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1、,血液一般检验主讲人：王新华,前言 血液标本采集 和血涂片制备,重点：血标本采集方法和血涂片制备技术 难点：各种抗凝剂的优缺点和使用选择,第一节 血液标本采集和抗凝剂选择,血标本： 全血：血细胞+血浆;临床血液学检查，血细胞计数、分类和形态 学检查 血浆：全血除去血细胞；血浆病理性和生理性化学成分的测定，内分泌激素、凝血因子（钙除外）、血栓和止血检查 血清：离体后血液自然凝固后析出的液体成分（除纤维蛋白原等凝血因子）；临床化学和临床免疫学检查，可见血浆与血清的主要区别是，血清中不含纤维蛋白原。,一、采血方法,静脉采血法部位：主要是肘静脉。还可以在：手背、内踝、股静脉，幼儿可采用颈外静脉采血采血
2、器材：一次性注射器采血步骤和注意事项：止血带压迫时间不能过长；注射器和容器必须干燥,采血步骤选择适宜静脉，在臂扎上压脉带，于穿刺处皮肤由内而外环形消毒 。让病人握拳，使静脉显露。左手拇指固定穿刺部位下端，右手持注射器，使针尖斜面和针筒刻度向上，先以约30o角度沿静脉正面进针，穿过皮肤刺人静脉腔。见回血后，右手固定注射器，用左手缓缓抽出注射器针栓，至所需血量后，解除压脉带，放松拳头，以消毒棉签压住穿刺孔，拔出针头 。,静脉采血法注意事项,1.注射器和盛血器皿清洁干燥 2.注射器与针头紧密衔接，不漏气，针尖不带钩 3.使针尖斜面和针筒刻度向上 4.抽血时只能外抽不能内推，以免形成气栓 5.采血前，
3、消除病人恐惧心理,部位：WHO推荐中指或无名指尖内侧为宜，耳垂采血受温度影响大；半岁以下拇指或足部，特殊人员视情况而定。 所用器材：采血针、吸管 采血步骤及注意事项：避免交叉应严格实行一人一针制；穿刺的深度的适当，切忌用力挤压，以免混入组织液，影响检验结果。用消毒干棉球擦去第一滴血，以后流出的血液可以使用。,皮肤采血法（毛细血管采血法）,部位：主要是肘静脉。采血器材：真空采血装置，头套式、头皮静脉式两种,真空采血法（负压采血法）,采血步骤及注意事项：利用真空贮血管中的负压原理，自动定量的将血液引入贮血管内；瓶塞穿刺针外具有止血护套，使用时请勿将其取下；采集血样后，针对有输液要求的患者，医务人员
4、可将软座与输液器相接进行输液，减少病人的静脉穿刺次数；一次性使用，用后销毁。既有利于标本的收集运送和保存，又便于防止血液交叉感染，已开始在国内推广使用。,方法学评价,静脉采血 皮肤采血 真空采血 缺点 不同抗凝剂的使用， 限制了重复实验； 价格高改变血液性质，影 易于溶血、凝血响有形成分的形态; 和可混入组织液环境污染 优点 标本代表性大，无 价廉、快速、操作 减少溶血，操组织液影响，适于 简便，标本可直接 作规范，防止临床研究，可重复 测定 交叉感染，保实验和追加其他实 护环境验,质量控制,患者：活动情况、精神状态、药物、年龄、性别标本采集等 采血：操作规范 溶血：采集、转移、保管、分离 血
5、标本处理：立即送检 实验结果分析：药物、饮食的影响；密切结合临床,二、抗凝剂选择,抗凝：用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固 抗凝剂：能够阻止血液凝固的物质，称抗凝剂,乙二胺四乙酸（EDTA）盐,抗凝原理：螯合钙离子使用方法：15g/L浓度EDTA 和血液 1：10适用范围：血细胞形态、血小板计数。但影响血小板聚集和白细胞吞噬功能所以不适合做凝血象检验及血小板功能试验,草酸盐 （sodium oxalate）,草酸钠 、草酸钾、草酸铵原理：草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固使用方法：草酸钠0.1mol/L 和血液1：9适用范围： 凝血象检查,肝
6、素（heparin）,原理：低浓度时抑制因子a、和PF3之间的作用，加强抗凝血酶（AT-）灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成,还能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子的作用；高浓度时阻断凝血酶和纤维蛋白的反应适用方法： 1g/L浓度的肝素钠与血液 1：10优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温适用范围：红细胞检验（红细胞计数、血红蛋白测定、红细胞比积）和多种生化分析,枸橼酸盐（枸橼酸三钠）,原理：螯合钙离子使用方法：配成109 mmol/L的浓度和血液1：9106 mmol/L的浓度和血液1：4适用范围：止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小）,物理方法抗凝,脱纤维蛋白：将血液注入有
7、玻璃珠的器皿中，转动，纤维蛋白缠绕凝固于玻璃球，从而防止血成凝块。适用于免疫学检验和红斑性狼疮细胞检查。,血液的贮存,1. 血液标本检验前的预处理 分离血清或血浆 预温血浆或血清 分离细胞,冷藏保存:血浆在4保存24h后，某些凝血因子活性减少95%。供血细胞分析仪使用的EDTA-k2抗凝全血应保存于室温，但不宜超过8h，如果在4保存可使血小板计数结果减低。 冷冻保存:要长时间保存血液中有活性的成分如凝血因子、酶类等，可采取分离血清或血浆后快速深低温冷冻的方式，冷冻的标本一般应避免反复冻融。 根据检验项目要求有些血液标本要求避光、隔绝空气等 ,如血液SB（标准碳酸氢盐）的测定，检验酸碱度。,2.
8、 血液标本的保存,3. 血液标本检验后的处理,血源性污染是医源性污染的主要来源之一，检验后的血液标本处理不当，其危害极大。对于检验完毕的血液标本首先要进行高压灭菌，然后再进行无害化处理。带有血液的检验器材要用消毒液浸泡。采血用的注射器要进行毁形、消毒并进行无害化处理。,第二节 血液涂片制备和细胞染色,血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。血涂片的用途：血细胞形态学检验、网织红、异常寄生虫检验。,玻片的清洁,将载玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20分钟，再用热
9、水将肥皂、血膜洗去，自来水反复冲洗，必要时用95%的乙醇浸泡1小时，擦干备用。 新玻片常有游离碱质，用重铬酸钾洗液或稀盐酸（浓盐酸稀释10倍）浸泡24小时，再彻底洗涤。 使用玻片时，要手持玻片边缘，以保持玻片干燥、清洁、中性、无油腻。,一、血液涂片制备,将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。,图1-3 血涂片制备示意图（上：侧面观，下：正面观）,血涂片质量评价,均匀、厚薄、头体尾、边缘、两侧注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚一张良好血涂片的标准是：厚薄适宜、头体尾分明、细胞分布均匀、边缘整齐、两侧及两头留有空隙，血膜长度约4厘米。,二、血液细胞染
10、色,染料：生物学染色剂，将生物组织细胞和病原体染色，在显微镜下观察结构。发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染组织亲合。,碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核的染料。如亚甲蓝、天青。酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分等。复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料,细胞染色原理：,一般以它们的物理现象和/或化学现象为依据。 物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等 化学作用：1.染料的化学成分：助色基团的存在，碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与组织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而
11、酸性染料在溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。2.蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同数量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同时还有其它活性基团。在游离状态时， -NH2获得一个H+变成 带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+变成带负电的-COO-。分别与不同染料结合。3.周围环境的酸碱度：如环境pHpI（ pI 为等电点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之， pHpI，则结合碱性染料。,细胞染色法的类型,普通染色法： 经物理和/或化学作用的吸附、结合荧光染色法：荧光染料，荧光显微镜细胞活体染色法：活体染料如灿烂甲酚蓝等细胞化学染色法：用化学反应显示细胞内某种成分细
12、胞免疫化学染色法（应用单克隆抗体技术、酶标记技术）,瑞氏染色法,瑞氏染料由酸性染料伊红（eosin,E-）和碱性染料亚甲蓝(methylene blue,M+)组成复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。将伊红和美蓝溶解在甲醇中，即瑞氏染料。,染色原理,细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染
13、料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。M+CL + Na+E ME + NaCL美蓝 伊红 伊红化美蓝（瑞氏染料）,图1-4 瑞氏染色原理示意图,PH对细胞染色有影响,细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用玻片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀释染色必须
14、用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。,试剂,Wright染液：瑞氏染粉0.1g, 甲醇60.0ml 甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态， 并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.4-6.8）：磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到1000ml。 配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。,瑞氏染色方法,1. 用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。2. 加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。3. 滴加等量或稍多的缓冲液
15、，混匀，染色5-10分钟。4. 用清水冲洗，待干后镜检。,【质量控制】,血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落.染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。染液不能过少，以防蒸发沉淀。冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料 沉着。冲洗时间也不能长。染色过淡，可复染。染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色.,【染色结果评价】,正常情况：血膜外观呈淡琥珀色。在显微镜下红细胞染成粉红色，在厚薄均匀处略有碟状感。白细胞胞质中的颗粒能显示出各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。染色环境偏酸：则红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞核呈浅蓝色或不着色，染色过酸pH
16、3.5时，则呈现一片红色，白细胞中除嗜酸性颗粒外均不着色。染色环境偏碱：则所有细胞呈灰蓝色，微偏碱者红细胞暗红、白细胞颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色甚至黑紫色或蓝色。中性颗粒也偏粗染成紫黑色，血膜过厚的地方呈绿色。,姬姆萨染色法,原理吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结 果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染10min。或先用瑞氏染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。,吉姆萨染料 1.0g 甘油 66.0ml 甲醇（AR） 66.0ml染色方法1. 甲醇固定干燥血膜3-5min2. 将血膜在染液中浸染10-30min3. 流水冲洗,待干后镜检,
