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1、正清风痛宁治疗类风湿关节炎 临床与作用机制研究,国家中医药管理局重点中西医结合风湿病专科 第三军医大学西南医院风湿病诊疗中心 方勇飞,正清风痛宁有效成份为盐酸青藤碱 以青风藤为原料提取 本草纲目称青风藤“主治风疾，风湿流注，历节鹤膝” 本草汇言记载：“青风藤散风寒湿痹之药也，能舒筋活血，久服必大建奇功” 。,青藤碱的特性,青藤碱(sinomenine,SN)是从青风藤根茎中分离提取的一种单体生物碱。 药用多为其盐酸盐，分子式C19H23NO4，分子量329.38。 从化学结构上看，由氢菲核和乙胺桥组成，结构类似吗啡,青藤碱抗炎抑制免疫的机制研究,国家自然科学基金（30300452）、重庆市中医
2、药基金（2003C77）及正清基金资助,本项目研究目标,与氨甲喋呤（MTX）相比较，初步探讨SN对胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠的关节积分，IFN-，抗型胶原抗体的影响初步探讨SN对佐剂性关节炎（AA）及CIA大鼠滑膜细胞表达与分泌IL-1、TNF-、IL-10的影响；从NF-B信号通路中相关环节来探讨其具体的抗炎机制及可能的量效关系,研 究 方 法,本研究分三部分 第一部分：建立CIA小鼠关节炎模型，行关节评分；夹心ELISA法检测脾细胞分泌IFN-的能力；间接ELISA法检测血清中抗型胶原抗体的水平，同时与MTX相比较 第二部分：建立AA及CIA大鼠模型，分离培养大鼠双膝滑膜细胞，运用反转
3、录-PCR检测IL-1、TNF-、IL-10的mRNA表达、EMSA检测NF-B的DNA结合活性、免疫印迹检测IB-的表达，间接免疫荧光法检测P65的核转位情况 第三部分：临床研究：ELISA检测RA中IL-1、TNF-、IL-10及CCP抗体经SN或MTX治疗前后的变化,第一部分 研究结果,正常DBA/1小鼠关节正常（A），其后爪的H&E染色表明无明显的炎细胞浸润（C）。而牛II型胶原可诱发DBA/1小鼠出现关节肿胀、屈曲等关节炎症（B），其后爪的HE染色表明有明显的炎细胞浸润（D）。 HE x 200,建立牛II型胶原诱发DBA/1小鼠关节炎模型,治疗分组,A.正常小鼠对照组 B.CIA：
4、生理盐水治疗组(阴性对照组) C.CIA：MTX 0.4mg/kgw治疗组(阳性对照组) D.CIA：MTX 0.4mg/kgw + SN 7.5mg/kgd治疗组 E.CIA：SN 7.5mg/kgd治疗组 F.CIA：SN 15mg/kgd治疗组,正常对照组小鼠未出现关节炎性改变，其他各组均有不同程度的关节炎症表现。从初次免疫后第28天起，MTX组、MTX+SN组、SN小剂量组、SN大剂量组小鼠关节评分均低于对照组。其中，MTX+SN组关节评分最低,不同治疗组小鼠脾淋巴细胞体外刺激后分泌IFN-水平,生理盐水对照组IFN水平明显高于正常对照组(P0.05)；各治疗组IFN水平均低于生理盐水
5、对照组，其中以MTX+SN治疗组最低，而两单个SN治疗组均高于MTX组,生理盐水对照组抗型胶原抗体水平高于正常对照组(1:10和1:100两个稀释水平P0.05)；各治疗组中抗型胶原抗体水平均低于生理盐水对照组，其中以MTX+SN治疗组最低，而两个SN治疗组均高于MTX组，与生理盐水对照组无显著差异,第一部分初步结论,无论大剂量还是小剂量应用SN治疗CIA，其改善炎症症状、抑制IFN和抗型胶原抗体的能力均不及经典抗风湿药物-MTX但SN与MTX联合治疗CIA优于其它SN或MTX单独使用的治疗方案,第二部分 研究结果,胶原诱导型关节炎大鼠模型建立,正常对照大鼠,CIA模型大鼠,正常大鼠与胶原诱导
6、性关节炎大鼠 后肢踝关节滑膜病理图片,正常大鼠（HE x400）,CIA大鼠（HE x400）,滑膜细胞的培养和鉴定,(倒置相差显微镜 x100),(倒置相差显微镜 x200),滑膜细胞的培养和鉴定,传代培养的大鼠滑膜细胞电镜图片(透射电镜 x4000),不同浓度SN对AA大鼠滑膜细胞表达TNF-、IL-1及IL-10mRNA的影响,RT-PCR图像显示，正常对照组滑膜细胞均有较弱的TNF-mRNA、IL-1mRNA及IL-10mRNA的表达，而这三种细胞因子在AA大鼠的表达较正常对照组均明显升高（P0.05） 随着青藤碱的体外剂量浓度逐渐从30g/ml增加至120g/ml时，TNF-mRNA
7、、IL-1mRNA的表达呈浓度依赖性地下降，而IL-10mRNA的表达亦呈下降趋势，但无浓度依赖性,大鼠滑膜细胞TNF-mRNA、IL-1mRNA的表达,TNF-,IL-1,Control,AA,SIN30g/ml,SIN60g/ml,SIN120g/ml,Marker,大鼠滑膜细胞IL-10 mRNA的表达,IL-10,-actin,Contrl,AA,SIN30g/ml,SIN60g/ml,SIN120g/ml,Marker,不同剂量SN对AA大鼠滑膜细胞内NF-B活性的影响,AA大鼠滑膜细胞内NF-B的活性较正常对照组明显活化。SN从30g/ml至120g/ml可浓度依赖性地抑制NF-B
8、活性经SN作用后，NF-B活性的变化趋势与TNF-mRNA、IL-1mRNA的相关性较好（r=0.810,P0.05）,核转录因子的检测用EMSA法，并用竞争性试验证实其特异性,NC,PC,NSC,SC100,SC200,SN对AA大鼠滑膜细胞NF-B活性的影响,lane1,lane2,lane3,lane4,lane5,lane6,Lane 1 NC; lane 2 contrl; lane 3 AA; lane 4 AA+ SN 30g/ml;lane 5,AA + SN 60g/ml; lane 6, AA+ SN 120g/ml.,SN对AA大鼠滑膜细胞IB-表达的影响,lane1,l
9、ane2,lane3,lane4,lane5,lane 1 contrl; lane 1 AA; lane 3 AA+ SN 30g/ml;lane 4,AA + SN 60g/ml; lane 5, AA+ SN 120g/ml.,SN对关节炎大鼠滑膜细胞P65核转位的影响,正常对照,关节炎,PDTC阳性对照组,50uM SN,500uM SN,细胞NF-B信号通路的调控作用,第二部分初步结论,SN通过抑制NF-B活性及IB-的降解而呈浓度依赖性地下调关节炎大鼠滑膜细胞内TNF- mRNA、IL-1 mRNA的表达 SN对关节炎大鼠滑膜细胞内IL-10 mRNA的表达亦呈下降趋势，但无浓度依
10、赖性 SN可呈浓度依赖性地抑制关节炎大鼠滑膜细胞P65的核转位,第三部分 研究结果,SN或MTX对RA患者血清TNF、IL-10及CCP抗体的影响,SN或MTX对RA患者血清TNF-a、IL-1、IL-10及CCP抗体的影响,与正常对照组相比，RA患者血清中TNF-含量明显增加，CCP抗体的相对滴度显著增高（P0.05） SN或MTX在治疗后1月及2月时均能显著降低RA患者血清中TNF-的含量（P0.05） RA患者有较高的IL-1的表达， SN或MTX在治疗1月及2月后IL-1beta的含量明显降低（低至无法检测出，未用图表显示） SN可通过降低RA患者中TNF- 、 IL-1 的含量而治疗
11、类风湿关节炎,青藤碱对类风湿关节炎患者滑膜细胞 凋亡的影响及机制的研究,重庆市中医药基金（2003C77）、正清基金资助,本项目研究目标,初步探讨SN对RA患者滑膜细胞的致凋亡及抑制增殖作用进一步探讨SN对RA患者滑膜细胞凋亡蛋白Bcl-2表达及细胞周期的影响，以了解其诱导凋亡的相关机制,研 究 内 容,收集RA患者滑膜组织（由我院关节外科中心提供），培养滑膜细胞，观察滑膜细胞形态，并测定其生长曲线凋亡效应的研究：SN对滑膜细胞增殖的抑制及致凋亡作用凋亡机制的研究：凋亡蛋白Bcl-2的表达及滑膜细胞周期的变化,滑膜细胞形态成纤维样滑膜细胞光镜下的结构40 光镜下见呈梭形或柱形，细胞核呈卵圆形，
12、位于细胞中央，核仁明显,滑膜细胞生长曲线,RA滑膜细胞接种后第7天数量达到高峰,滑膜细胞凋亡效应的研究,一、MTT法检测SN对RA滑膜细胞的增殖抑制作用,滑膜细胞加药处理后OD值均明显低于于未加药组（P0.01,n=5）,二、光镜下RA滑膜细胞凋亡形态,加药后部分细胞由贴壁脱落而呈悬浮生长，贴壁能力减弱，细胞形态变圆，体积缩小，核固缩出现。3.2mmol/LSN作用48h组尤为明显。不含药培养液培养的对照组细胞贴壁生长，几乎无脱落，胞浆饱满，生长舒展，相邻细胞生长融合成片RA滑膜细胞光镜下的结构 40 3.2mmol/LSN作用滑膜细胞48h 40,三、荧光显微镜下RA滑膜细胞凋亡形态,荧光显
13、微镜下见正常对照组细胞核较大，呈均匀弥散荧光；处理组细胞出现典型的凋 亡核形态学改变，表现为核体积缩小，大小不一，染色不均匀，呈致密浓染的颗粒或 块状增强荧光正常滑膜细胞核（200）青藤碱终浓度2.8mmol/L（200）12小时 24小时 48小时,青藤碱终浓度3.0mmol/L（200）12小时 24小时 48小时青藤碱终浓度3.2mmol/L（200）12小时 24小时 48小时,四、流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡率,滑膜细胞加药处理后凋亡细胞百分率均明显高于未加药组（P0.05,n=5）,结 果,MTT法显示2.8mmol/L、3.0mmol/L、3.2mmol/L的SN作用24、48 h
14、能够抑制滑膜细胞增殖，其中以3.2mmol/L作用48h最明显光镜、荧光显微镜下发现2.8mmol/L、3.0mmol/L、3.2mmol/L的SN分别作用后滑膜细胞出现凋亡表现，如细胞变圆、胞体皱缩、细胞核荧光染色增强等不同浓度的SN分别作用于滑膜细胞，凋亡率呈浓度依赖性，与对照组比较有显著差异(P0.05)，其中3.2mmol/L浓度的SN作用48h对滑膜细胞凋亡影响最为显著,滑膜细胞凋亡机制的研究,一、SN对RA滑膜细胞周期时相分布的影响,不同浓度SN作用RA滑膜细胞48h对G0/G1期的影响（xs，n=5） SN（mmol/L） G0/G1（） t P正常对照 85.98600.812
15、5 2.8 88.13401.5070 2.743 P=0.0230.053.0 89.64603.1585 2.509 P=0.0360.053.2 92.09001.6589 7.389 P=0.0000.01不同浓度SN作用RA滑膜细胞48h对S期的影响（xs，n=5）SN（mmol/L） S（） t P 正常对照 0.8540.6172 2.8 1.20400.4202 1.048 P=0.3250.053.0 1.18400.6744 0.807 P=0.4430.053.2 1.11800.4437 0.777 P=0.4600.05,不同浓度SN作用RA滑膜细胞48h对G2/M期的影响（xs，n=5）SN（mmol/L） G2/M（） t P正常对照 13.16201.2309 2.8 10.66401.2241 3.218 P=0.0120.05 3.0 9.17602.7400 2.967 P=0.0180.05 3.2 6.79001.8416 6.432 P=0.0000.01 不同浓度SN对RA滑膜细胞作用48h，实验结果表明G0/G1期的细胞百分比逐渐增加（P0.05）；S期细胞百分比无明显变化；G2/M期比例显著减少（P0.05）,
