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1、细菌的接种、分离与鉴定思路,常用细菌培养方法,需氧培养法(一般培养)适用于需氧菌和兼性厌氧菌培养。 培养温度:37(采用恒温培养箱)。 培养时间:1824h。,二氧化碳培养法 适用于奈瑟菌属和布鲁菌属等苛养菌培养。 可采用烛缸法、二氧化碳培养箱。,微需氧培养法适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等微需氧菌培养。可采用抽气换气法。厌氧培养法适用于专性厌氧菌培养。厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等。,细菌接种的基本程序,灭菌接种环,沾取标本,接种,灭菌接种环,杀灭接种环沾染的细菌,以免污染标本,杀灭接种环沾染的细菌,以免污染环境,带菌接种环的正确烧法,热导法:从环的根部(靠近柄部)开始
2、烧,通过热传导让接种环或针上带的菌慢慢受热,直至干燥,最后放在氧化焰(外层温度高)上彻底灭菌。从还原焰开始法:(内层温度低),带菌的接种环或针直接置于此不会引起气溶胶喷溅,待完全干燥后再移至氧化焰部位彻底灭菌。,接种方法,平板划线法 原则和目的:通过划线稀释细菌 获得单个菌落 要领: G 划线均匀而细密,不重复。 A 充分的利用培养基的面积。 B 培养基不能划破。 GB 培养时培养皿倒置。,培养时培养皿倒置的原因,一 防止培养基的水分蒸发 二 防止形成的冷凝水滴落在培养基上造成染菌三 倒放可以在某种程度上防止菌落蔓延,好形成单个菌落,利于计数 四 防止外来的污染,平板划线法,(1)连续划线法此
3、法多用于含菌量相对少,无菌部位来源的如血液,胸腹水,脑脊液等标本的细菌分离培养。,(2)分区划线法(可分二区,三区和四区)此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁等标本的细菌的分离培养。,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,(3)密集划线法 此法用于纸片药敏实验培养,密集划线法,用于药敏实验,细菌在固体培养基中生长表现: 1、大小 ( mm表示。1mm以内露滴状;1-2mm小菌落。2- -4mm中等大菌落;4-6mm以上称大菌落或巨大菌落) 2、形状 (圆形、不规则形) 3、边缘 (整齐、锯齿状) 4、表面性状(光滑、粗糙、) 5、隆起度(扁平、隆起、中凸) 6、颜
4、色及透明度(黄色、灰白、光泽、透明) 7、硬度(干燥、湿润、粘液) 8、溶血(在血培养基上的表现),试管培养基接种法,琼脂斜面接种法该法主要用于纯种增菌及保存菌种,也可用于某些生化鉴定试验如双糖铁培养基的接种。,手执塑料杆处,小指夹棉塞,试管口离火焰1cm,手执试管底露出斜面,操作顺序:接种环灭菌 勾取细菌 取棉塞 接种 塞棉塞 接种环灭菌 标记 培养。,细菌分离培养,选择适合细菌生长的条件和温度,按无菌操作选择适合细菌生长的培养基接种量少,革兰氏染色法步骤一般包括初染、媒染、脱色、复染1)涂片干后加热固定。 2)结晶紫染30s,水洗 3)加碘液约30s,水洗4)加95%酒精数滴,摇动脱色,3
5、0秒-1分钟,至无紫色脱落为止,水洗5)加复红染色染,染30秒后,水洗。 干燥,镜检。,+C鉴定思路,乳糖-,触酶+ 微球菌科,O/F试验氧化型 微球菌属,h2o2+,触酶- 链球菌科,血浆凝固酶-,新生霉素敏感试验S 表皮葡萄球菌,O/F试验发酵型 葡萄球菌属,血浆凝固酶+ 金黄色葡萄球菌,新生霉素敏感试验R 腐生葡萄球菌,Mac生长试验阳性 肠链球菌属,靛基质-,Mac生长试验阴性,溶血Optochin S为肺链 R为甲链,溶血 杆菌肽S为A群链 CAMP试验+为B群链,-b鉴定思路,乳糖-,OX+双糖- 非发酵菌科,鞭毛染色-为黄杆菌属莫拉菌属,h2o2+,OX 双糖+ 肠杆菌科,端鞭毛为假单胞 一根鞭毛为绿脓 周鞭毛为产碱杆菌,动力-NIT-不动杆菌 动力+NIT+嗜麦牙单胞菌,IMVC + + - -为大肠 - + +为产气和肺克 + - +为沙门 D + - -为志贺,PD 葡萄糖酸盐,Ox-双糖- 非发酵菌科,Ox+双糖发酵型 弧菌科 0/129R为气单胞菌 S为弧菌属和霍乱弧菌,实验安排:,每人一个营养琼脂平皿做划线分离,要求分出单个菌落。(培养时倒置) 每人一支营养琼脂斜面做斜面接种。,感谢聆听!,