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1、同工酶技术 及其在植物育种上的应用,1 同工酶技术,1.1 同工酶的概念,同工酶：催化同一生化反应的、在电场中的运动性质有所不同的酶的多种形式。Markert，Moller 乳酸脱氢酶等位酶：同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式。,1.2 酶电泳的原理,1.2.1 酶蛋白质的结构,蛋白质有酸碱性质和四级结构 1.初级结构： 2.二级结构和三级结构 3.四级结构,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,酶是蛋白质，有四级结构，也有酸碱性质。 通常每一种酶蛋白质的亚基数目是固定不变的。,1.2.2 电泳原理,粒子在电场影响下的移动。U=Qd/4r2 把含有各种蛋白质的组织匀浆样品放在
2、凝胶里，电泳后，由于它们的净电荷极分子大小形状不同而移动速度不同，各种蛋白质分散在电泳跑道上，这时它们是看不见的。 专性的组织化学染色来使它们被看见。,2.酶蛋白质电泳的遗传学解释,酶谱上的带是酶蛋白质基因的表现型，而不是酶基因或酶基因型本身： （1）代表等位基因的带 （2）代表同一基因位点的带 （3）次生杂聚体酶带 （4）人为带和其他非遗传带,酶谱带型和带的数目： （1）酶本身结构； （2）在细胞中的分布； （3）编码基因来源。,酶蛋白质都是由DNA编码通过RNA合成的； 所以使用等位酶资料的根据是： （1）酶在电场里移动性的改变反应了编码DNA的改变，所以酶谱类型是遗传的； （2）大多数酶
3、的不同形式都是等显性的。,选作遗传学分析的酶,单体酶 二聚体酶 四聚体酶,2.1 同工酶在细胞内的分布,细胞液（细胞溶质） 质体（叶绿体等） 线粒体 微粒体,2.2 二倍体植物的基因型与酶型,基因型 酶型：单体酶A1，二聚体酶A1A1，四聚体酶A1 A1 A1 A1.,2.2.1 单体酶的酶型,基因型 a1a1 a1a2 a2a2 酶谱带型 A1 A1 A2A2,2.2.2 二聚体酶的酶型,基因型 a1a1 a1a2 a2a2 酶谱带型 A1A1 A2A2A1A1 A1A2 A2A2,2.2.3 三聚体酶的酶型,基因型 a1a1 a1a2 a2a2 酶谱带型 A1A1A1 A2A2A2 A1A
4、1A1 A1A1A2 A1A2A2 A2A2A2,2.2.4 四聚体酶的酶型,基因型 a1a1 a1a2 a2a2 酶谱带型 A1A1A1A1 A2A2A2A2 A1A1A1A1 A1A1A1A2 A1A1A2A2 A1A2A2A2 A2A2A2A2,2.2.5 二倍体植物的居群或种内基因型与酶型,进行等位酶分析时，都要进行群体随机取样，在几十或成百上千的样品个体中，看到的等位基因就不止2个。 在一个二倍体植物的居群或种内，不同的个体中各等位基因可能纯合，也可以两两组合形成各个种杂合基因。,有三个等位基因的一个单体酶位点在二倍体植物群体中可能的基因型与酶型的关系。（P178）,有三个等位基因的
5、一个二聚体酶位点在二倍体植物群体中可能的基因型与酶型的关系。（P179）,有三个等位基因的一个四聚体酶位点在二倍体植物群体中可能的基因型与酶型的关系。（P179）,有3个以上等位基因的二倍体植物居群的基因型种类,T=m!/2(m-2)!+mT为基因型的种类数；m为等位基因的数目；！为阶乘。在各种杂合情况下，单体酶具有2条带、二聚体酶具有3条带，四聚体体酶具有5条带。,2个个体的酶谱不同未必不是一个种，带多的未必是基因变化多。,直接把酶谱上带的多少或迁移率作为数量性状进行遗传学计算或聚类分析那将是十分危险和错误的。 进行等位酶分析必须采取尽量多的样品，检查尽量多的酶，而且必须正确地解释酶谱上看到
6、的带。从酶谱上找出真正代表位点和等位基因的信息。,掌握原则,不同位点的酶带往往相距较远，二聚体以上的酶的带之间不形成杂合酶型的带； 在单体酶的酶谱中，每种酶型都代表1个等位基因；在二聚体以上的酶的酶谱中，凡酶型为纯合的才能代表等位基因，不同的纯合酶型代表不同的等位基因。,3 同工酶技术在植物育种上的应用,3.1 在遗传多样性研究上的应用,在种内水平上，等位酶可作为一种稳定的遗传标记，通过等位酶分析可以测量遗传变异性，常用的指标：,1.多态位点的百分数P； 2.平均每个位点等位基因的有效数目Ae； 3.平均每个位点的观察杂合度Ho； 4.平均每个位点的期望杂合度。,了解一个种在分布区范围内各种群
7、的基因丰富程度及各种群内和种群间的等位基因的组成、分布情况以及等位基因在空间和时间上的动态变化情况。,2000年黎中宝等，研究两种不同生境的桐花树种群的遗传多样性和遗传分化。桐花树种和种群水平都维持有较高的遗传变异性。,1986年，江洪等根据同工酶结构基因定位和形态特征，推知TAT系列中的冰草染色体与小麦的同祖群有一定部分同源关系。 1999年，郎萍等对栗属中国特有种种群的遗传多样性研究，揭示了长江流域的神农架及周边地区为中国板栗的遗传多样性中心。,3.2 在品种鉴定上的应用,同工酶多态性小，仅用一种同工酶只能部分区别品种，需多种酶系一起分析才可以将所有品种一一区别。,王家保等（2004）用过
8、氧化物酶、酯酶和淀粉酶同工酶区分11份莲雾品种。 孙彩云等（2002）用酯酶、苹果酸酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸葡萄糖变位酶、超氧化物歧化酶5种酶系统研究墨兰和春兰17个变种及品种的同工酶多样性，能够把供试品种和变种区分开来。,莫饶2005年建立了10个咖啡中粒品种的POD同工酶指纹，鉴别出4个品种的差异。,3.3 种子纯度鉴定上的应用,利用同工酶技术可以较为快捷、有效及低成本地检测种子的纯度。 方宣钧等1997年，筛选出5个杂交水稻组合特异性等位酶标记，辅助标记鉴定标记9个，可对供试的9个杂交水稻组合进行真伪及纯度鉴定。,吴建梅等2003年，采用酯酶同工酶电泳法，对10份特优系列组合进行纯度鉴定，与田间种植鉴定很好吻合。,3.4 杂交后代的分析,利用同工酶对杂交后代进行分析可了解相关遗传信息。,3.5 外源DNA导入后代的检测,外源DNA导入的受体和后代，出现明显的酶谱变化。 卢翠花等（2000）将芸豆、玉米的总DNA导入大豆其后代发生明显变异，过氧化物酶和多酚氧化酶酶谱发生变化。 刘萍等认为，可以用同工酶分析作为鉴定外源DNA导入的生化指标之一。,3.6 诱变处理后代分析,辐射处理后代植株在过氧化物酶和酯酶的酶谱带型及活性上有明显变化。,3.7 组织培养中间培养物分析,3.8 抗性鉴定,
