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1、椎间盘退变基因治疗进展 Current Advances in Gene Therapy for Disc Degeneration,胡有谷 陈伯华 刘勇 马学晓青岛大学医学院附属医院 脊柱外科 山东省创伤骨科研究所,引 言,腰椎间盘退变为腰背痛重要原因 腰椎间盘退变始于18-20岁，随年龄增加而加重腰椎间盘退变疾病椎间盘源性腰痛腰椎间盘突出症 腰椎间盘狭窄症 腰椎滑脱 腰椎侧凸,引 言,Vit D 多形核细胞受体基因 IX型胶原等位基因 MMP-3基因 聚集蛋白多糖基因 24 新基因聚集蛋白多糖基因,ECM生物化学,生物力学,II型胶原聚集蛋 白多糖,细胞功能减退细胞凋亡,Videman T
2、, et al. Most of the 28 studied candidate genes were associated with the degenerative MRI findings in the intervertevral discs. ISSLS. Bergen ,Norway (2006):21,腰椎间盘退变的因素,基因学,细胞学,椎间盘退变的生物学治疗 基因治疗细胞治疗组织工程,基因治疗概念,基因治疗 将缺陷性或缺失性RNA和DNA，改变其蛋白 质的表达治疗疾病 基因治疗原理 外源性基因RNA或DNA 转染至靶细胞 引起外源基因表达加强对靶细胞中降低或缺乏的有利的蛋白质
3、合成恢复靶细胞的正常功能和形态,，,NIH 2000年初， 300个项目，3500例 临床I期基因治疗疾病的基因治疗癌症的基因治疗神经系统疾病的基因治疗Alzheimers diseaseParkinsons disease血管疾病的基因治疗内分泌疾病的基因治疗特殊感觉器官障碍的基因治疗,骨科疾病基因治疗,1993年 类风湿性关节炎回体基因治疗体内基因治疗 质粒DNA反义脱氧寡核苷酸Roessler B, et al. Adenovirus-mediated gene transfer to rabbit synovium in vivo. J Clin Invest 1993; 92:108
4、5 Chemajovsky Y, et al. Gene therapy for rheumatoid arthritis. Drugs 12:29 -41 1996年 骨折骨不连BMP -4质粒和甲状旁腺激素质粒DNA片段双质粒基因活化基质（gene activated matrix，GAM） 填充骨缺损新骨形成 Fang J,et al. Stimulation of new bone formation by direct transferof osteogenic plasmid genes. Proc Natl Acad Sci 1996, 93:5753,1997年 成骨不全Mar
5、ini和Gerber 脂质微胶(lipidoligomicelle)将脱氧寡核苷酸 (oligodeoxynucleotides, ODN) 转入OI患者的培养细胞，靶向突变的mRNA有50%受到抑制Marini JC., Gerber NL_Osteogenesis imperfecta Rehabilitation and prospects of gene therapy. JAMA 1997, 277:746,骨科疾病基因治疗,椎间盘退变基因治疗 1992年 Lettice 等 狗退变椎间盘注入EGF和 FGF1997年 日本Nishida等 腺病毒介导hTGF-1 cDNA转染体内椎
6、间盘髓核细胞1997年 Wehling 等逆转录病毒 介导IL-Ira cDNA转染体外培育的牛椎间盘软骨终板的软骨细胞1999年至今 山东省创伤骨科研究所开展椎间盘退变基因治疗,Wehling P et al. Transfer of genes to chondrocytic cells of the lurnbar spine. Proposal for a treatment strategy of spinal disorders by local gene therapy. spine 1997,22:1092Nishida K et al. Adenovirus mediated
7、 gene transfer to nucleus pulposus cells.Tmpications for the treatment of intervertebral discdegeneration. Spine 1998, 23:2437,基因治疗慨念,基因治疗实验研究程序靶细胞的确定目的基因的选择载体的选择基因的表达转基因后生物学效应的验证,椎间盘退变基因治疗进展,目的基因应用趋向病毒类载体应用进展基因表达调控椎间盘退变动物模型建立和观察基因治疗的安全性,椎间盘退变基因治疗进展 目的基因应用趋向,细胞因子分类抗分解代谢细胞因子 基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）白细胞介素-l
8、(IL-I)受体拮抗剂促细胞分裂素 胰岛素生长因子( IGF-1)生长分化因子-5 (GDF-5)血管内皮生长因子(VEGF)结缔组织生长因子(CTGF) 骨诱导形成素 转化生长因子 (TGF-家族)骨形态发生蛋白(BMP家族) 细胞内调节因子 骨诱导蛋白-I (LMP-1)SOX-9基因。,椎间盘退变基因治疗进展 目的基因应用趋向,上述4类细胞因子为椎间盘退变基因治疗所选用的目的基因 目前亦有新入选的细胞凋亡抑制因子survivin各类细胞因子对细胞外基质影响不同TGF- 蛋白多糖和II型胶原均能发挥上调作用SOX 9 为转换因子，其增加II型胶原表达，Survivin 可抑制IL-3、TN
9、F、BAX、FAS等引致细胞凋亡的细胞因子,正向调控因子 基质合成因子 TGF- BMP CTGF bFGF,TGF-,CTGF,椎间盘退变基因治疗进展 目的基因应用趋向,多细胞因子基因转染2004年以前为单细胞因子目的基因应用双细胞因子基因转染 本研究所 TGF-1和TGF-3 双正向调控细胞因子 TGF-1和VEGF 双正向调控细胞因子 OP-1和SOX-9 双正向调控细胞因子 TGF-1和TIMP-1 单正向调控细胞因子,MMP抑制因子本研究所 双正向调控细胞因子转染优于单细胞因子转染的效果Leckie等 AAV-BMP2和TIMP1体内试验显示能延缓椎间盘退变Haschtmann等 B
10、MP-2 和TGF-3不能阻止椎间盘退变 . Leckie SK, Bechara BP, Hartman RA, et al. Spine J 2012;12:720Haschtmann D Ferguson SJ Stoyanov JV. Eur Spine 2012 21:17241733,椎间盘退变基因治疗进展 目的基因应用趋向,三细胞因子基因转染2008年 Moon和Nishida提出基因治疗多细胞因子转染鸡尾酒式治疗性基因转染(“cocktail“ therapeutic gene transfer)体外试验 Ad/TGF-1, Ad/IGF-1, Ad/BMP-2蛋白多糖含量 双
11、细胞因子转染较对照组增高3.2 to 3.9倍三细胞因子转染较对照组增高4.7倍 Moon SH, Nishida K, Gilbertson LG, et al. Spine 2008; 33:1850-52011年 本研究所 体外试验 HIV/hTGF-3、CTGF, TIMP-1 三细胞因子转染较双细胞因子转染蛋白多糖含量增高1.5倍 HIV/h survivin、TGF-3、TIMP-1三细胞因子转染较双细胞因子转染不增加细胞外基质蛋白多糖含量， 型胶原,椎间盘退变基因治疗进展 病毒类载体应用进展,裸露的目的基因DNA不能直接导入细胞内细胞的目的基因转染需要通过载体外源性基因真核表达载
12、体 非病毒类病毒类逆转录病毒 腺病毒 腺相关病毒 上述病毒类 携带细胞因子目的基因容量有限目的基因表达时间短转基因后的生物学效应随时间延长而下降,椎间盘退变基因治疗进展 病毒类载体应用进展,慢病毒 (Lentiviral vector，LV)慢病毒染色体组载体特点可用于各种组织的靶细胞能承载更多的基因载荷，可携带较大基因组可将目的基因高效整合至基因组DNA而稳定表达高效感染分裂期及非分裂期细胞利于靶细胞的基因表达调节不易诱发宿主免疫反应，属于低毒性病毒载体Kim Y, Tewari M, Pajerowski JD, et al J Control Release 2009, 134: 13
13、Cao F, Xie X, Gollan T, et al Mol Imaging Biol 2009 (Epub ahead of print) Dullaers M, Breckpot K, Van Meirvenne S, et al Mol Ther 2004, 10: 768779.,椎间盘退变基因治疗进展 病毒类载体应用进展,当前应用的慢病毒主要为HIV（Human Immunodeficiency Virus）较其它病毒类载体和非病毒类载体更适于转染非分化、分化缓慢和静止期的细胞动物模型中成功地用于治疗各种基因缺陷性疾病和生理性疾病本研究所应用慢病毒HIV构建多目的基因质粒转染椎
14、间盘HIV/survivin TGF-3 TIMP-1HIV/hTGF-3 CTGF TIMP-1临床应用前的研究结果显示人类基因治疗可应用慢病毒HIV载体HIV病毒可作为安全性的转基因载体Pluta K Kacprzak M M Acta Biochimica Polonica 2009, 56:531 近年来神经系统退行性疾病和血液病等应用慢病毒载体基因治疗 Nanou A, Azzouz M Prog BrainRes 2009 175: 187Neschadim A, McCart JA, Keating A, et al. Biol Blood Marrow Transplant 2007 13: 14071416,椎间盘退变基因治疗进展 基因表达调控,RNA干扰技术 (RNA interference，RNAi)椎间盘退变的延缓和逆转 提髙细胞外基质合成下调蛋白降解酶活性RNAi技术原理导入与内源性基因同源的双链RNA序列(siRNA) siRNA与靶基因的mRNA的特异序列结合,抑制mRNA的翻译,增强内源mRNA的降解下调某些特殊基因表达或高效阻抑基因表达达到阻止目的基因表达和基因沉默,
