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1、转基因动物的研究,转基因动物 Transgenic animal,1980年Gordon首次获得了转基因小鼠；1982年Palmiter将大鼠生长激素基因导入小鼠胚胎，得到生长速度快2至4倍，个体比同类大一倍的“超级小鼠”。这一研究结果，说明通过对性细胞的操作，可以有效地将外源基因导入动物的基因组内，并能使之表达，产生相应的生理效应。标志了人为地改变动物经济和遗传性状成为可能，开创了生命科学中新的研究领域。,生命科学中一个多层次、多侧面、四维的研究体系。,继连锁分析、体细胞遗传、DNA重组之后，遗传学中的第四代技术。,具有形成新兴产业的开发前景和潜能。,转基因动物 Transgenic ani
2、mal,转基因动物是指应用生物工程技术培育的、含在基因组内稳定地整合、并能遗传的外源基因或特定DNA片段的动物 。,首例整合有不同外源基因的转基因动物转基因兔 (Brem 1985) 转基因绵羊 (Hammer 1985) 转基因猪 (Hammer 1985) 转基因牛(Roschlau1989)转基因山羊 (Ebert 1991) 转基因鱼 (朱作言1986)转基因鸡 (Sang 1994),转基因小鼠已大量应用于基础研究的各个领域，而转基因大动物（家畜）则在应用研究中显示出良好的应用前景。,制备转基因动物的基本过程,（上游） 目的(外源)基因的克隆及重组 （中游） 重组(外源)基因向载体细
3、胞的转移( 依据外源基因的性质、受体动物和载体细胞的类 型，常采用反转录病毒转染、干细胞转移、电击法、精子携带、显微注射等不同的技术途径。)（下游） 转基因的检测及转基因动物的培育,出于安全性考虑，反转录病毒转染法主要是作为实验手段应用于转基因动物的研究。,反转录病毒基因转染 法,反转录病毒(retrovirus,RV)是RNA病毒，含两条RNA，进入细胞后，反转录成双链DNA，通过DNA进行复制。己有几种哺乳类和禽类的反转录病毒，作为转基因载体 (复制缺陷型和复制互补型)。,将外源基因与反转录病毒的原病毒重组，与细胞或胚胎共培养，通过感染将外源基因转导到载体细胞的常染色体或性染色体上。这一过
4、程都是由病毒编码的酶所介导的 。,优点:单拷贝基因导入且转导效率高，可达100%；整合常发生在病毒基因片段上，宿主基因不会被破坏；整合受病毒基因插入机制控制，不易发生大的突变；单一位点整合，易分析插入位点；,缺点:经嵌合体途径，实验周期长；转导基因不能超过10kb；不安全。在外源基因整合的同时，病毒基因也被整合到宿主染色体上，造成野生型病毒污染，有突变成新病毒及激活致癌原基因的可能。,胚胎干细胞转移基因转移 法,应用胚胎干细胞进行基因转导，不仅整合率较高，并能在细胞水平对外源基因的表达载体进研究筛选，结合相关技术手段，能实现定点操作，比如基因剔除(gene knockout)、基因置换(gen
5、e knockin)。,胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，简称ES细胞)是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，如给予适当环境即可形成胚系集落。,因此，胚胎干细胞经转染并鉴定后，移植到哺乳动物正常发育的囊胚腔内，再将囊胚植入假孕动物子宫中，可产生嵌合体动物。转化的细胞在嵌合体中能分化发育成为全能的生殖细胞，经简单的杂交繁育即可得到携带外源基因的纯合转基因动物。,但获得哺乳动物胚胎干细胞的克隆株系具有相当的难度。目前，该方法仅在转基因小鼠的研究中应用较为成熟。,以精子作为基因的裁体制作转基因动物以其简单、高效、广泛适用的特点引起众
6、多的科学家的广泛兴趣，大量实验证实，精子能够吸附外源DNA，而且大多数被吸附的外源DNA位于精子头部的赤道段和顶体后区，精子这种吸附DNA的能力不是简单的物理过程而是由精子头部蛋白所介导的。极少数DNA能够穿入精子核区，这部分DNA在核区内有的被降解；有的以附加体形式存在于基因组之外，只有极少数能够整合到基因组上，而且这种整合不是随机发生的。虽然精子吸附外源基因，通过体外受精或人工授精的途径制作转基因动物的阳性结果和阴性结果的报道时有发表，但是这些实验之间转基因效率差异极大，而且未能获得足够的数据对这一差异提供解释，没有从理论上阐明精子携带外源基因入卵的机制，也没有建立一套可重复性的稳定的制作
7、转基因动物技术路线。,精子载体法转基因,子,子,子,子,应用显微注射法制备转基因动物的技术路线,超数排卵,手术法回收受精卵,原核期受精卵,雄性原核,胚胎移植,产仔,外源基因,显微注射,受体母猪,同步发情,假孕母猪,每微升约含1000个拷贝基因,离心是显示原核有效的方法,外径1-2微米玻璃微针，向原核注入1-2微升,配种后18-24小时，输卵管回收,移植至同步化处理的受体输卵管内,外源基因显微注射法具有外源基因的长度不受限制，可直接转导不含载体的DNA片段，实验周期短，且较安全，是目前培育转基因动物最有效、成功率较高的技术途径； 影响因素：DNA浓度、缓冲液成份、基因构型、注射部位等 阳性率(以
8、移植产下的原代活仔畜计)： 小鼠(17.3%)、家兔(12.8%)、大鼠(17.6%)、 牛(3.6%)、猪(9.2%)、绵羊(8.3%)。,人类疾病动物模型,特有性状的经济动物,动物生物反应器,异种器官移植,转基因动物 Transgenic animal,己培育了许多种(如白血病、高血压、肿瘤、老年病等)转基因小鼠，使人类对致病基因的发病机理、遗传规律及基因表达与结构、环境因素的关系有了一个深入的了解，从而能进行科学的诊治。,动物模型(转基因鼠),由于小鼠与人类基因具有很高的同源性，且遗传背景清晰，因此含有人类致病基因的转基因小鼠所表现的症状，与人类相应疾病具有很高程度的可比性和真实性。,同
9、时，转基因小鼠通过对外源基因的操作，能从分子、蛋白、细胞、生理、遗传等不同水平，直接研究外源基因在个体内的动态表现，能精确地检测到一个遗传改变所发生的效应,四维的研究体系。,转基因经济动物,受“超级小鼠”的启发，人们希望通过转移和表达适当的基因，进行转基因育种，就可以培育出生长快、节省饲料和抗病的经济动物，使畜牧业和水产养殖业的效益成倍提高。,已获得整合有生长激素（GH）、生长激素释放因子（GRF）、肌肉生长刺激因子（cSK1）及能提高羊毛质量、牛奶产量等外源基因的转基因家畜。其中含有GH的转基因猪己稳定地的遗传了五个世代，其血液中GH均保持较高浓度，虽个体不比同胞更大，但体重增长较快，料肉转
10、化率提高17%，背膘厚度从18.51.8毫米下降到7.01.8毫米；,因此，在转基因育种方面尚有待新技术、新理论的突破。,但由于动物的经济性状(如生长速度、瘦肉率、产蛋量等)一般是由多个基因协调控制的，仅转移单个基因较难达到理想的效果。如整合有生长激素基因的猪和羊，其血液中的生长激素水平显著提高，在表现出生长快、饲料省、瘦肉率高的同时，也存在体质普遍下降及有繁殖障碍等不良性状，难以推广应用。转基因鱼是个例外。,前期转基因动物的研究，己证实了人类基因不仅能在动物体内获得表达和遗传、并能获得组织特异性（如乳腺、血液、膀胱）和发育特异性（如泌乳期）的表达。其中以乳腺生物反应器的进展最引人注目。,动物
11、乳腺是一个封闭系统，外源基因局限在乳腺表达，可避免外源蛋白对动物健康的危害。产量高，一头牛可年产乳蛋白250-300千克，绵羊和山羊也可产25-30千克。活性好，乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确修饰和后加工，产品的生物活性接近天然产品。可遗传，一旦获得一个生产某种有价值蛋白质的动物个体，通过常规繁育可扩大群体。成本低，虽前期投资大，但生产群体维持生产费用却很少。,转入人医用蛋白基因,产出含医用蛋白的牛奶,生物反应器,通过生物个体代替部份物理装置，以生物反应代替部份化学反应，来生产价值极高的蛋白质和多肽物质己为可能。人们将外源基因的信息转变成蛋白质的生物体(通常分为植物、动物两大类)称为生物反应
12、器。,Target proteinexpression vector,Transgenic milk production herd,Transgenic milk,Test offspring for transgene,乳腺生物 反应器成功的 基础和关键,目前，国际上己有多种转基因动物（绵羊、山羊、猪和牛）能生产上百种医用蛋白，其中有30余种进入、期临床，有的也己进行商业开发，产生了良好的经济效益，正逐步发展成一新兴产业。,全球排名前50位的医药企业，有75%投入转基因动物的研发。,如荷兰金发马公司培育的转基因牛，生产人乳铁蛋白，提炼的营养奶粉销售额为50亿美元；英国罗斯林研究所培育的抗胰
13、蛋白酶转基因羊，每升羊奶价值6000美元；芬兰得到红细胞生成素的转基因牛，年产奶价值为40多亿美元。,据美国红十字会和遗传学会预测，到2010_2015年，所有基因工程药物中，利用乳腺生物反应器生产的份额将占95%，约300亿美元。,器官移植已成为治疗多种器官衰竭的有效手段，因人类同种移植器官的日益缺乏，人们希望能实现异种器官的移植。猪在解剖、生理等方面与人具有较大的相似性，且易繁殖饲养被选为人类移植用异种器官的主要供体动物。,异种移植目前最大的障碍，便是受体对异种器官的超急性排斥反应，克服这一障碍便成为异种器官移植成功的一个关键。,但猪血管内皮细胞具有糖类表面抗原Galal-3Galal-4
14、GlcNAc-R（aGAL），器官移植后，被人血清中预存的天然抗体（Xenorective natural aneibodies，XNA）所识别，触发补体分子的活化，形成攻膜复合体（MAC），发生细胞裂解作用，导致猪器官在十几分钟到几小时内就被排斥，即发生超急性排斥（Hyperacute rejection，HAR）。,异种器官移植,应用转基因技术，培育表达人补体调控蛋白，如人膜辅助因子蛋白（human membrane cofactor protein MCP）、人衰变加速因子（human decay-accelerating factor DAF）的转基因猪，有望抑制或减弱人补体对猪器官的
15、攻击。,图为2001年12月底出生的5只可爱的转基因克隆小猪。据培育者英国PPL医疗公司称，这些转基因小猪将为研究和“生产”适用于人体移植手术使用的动物器官提供巨大的帮助。,表达混乱：1.不在预期的组织内表达； 2.子代表达情况不同；3.同一启动子在不同个体或不同动物中表达行为不同；4.整合不表达。,外源基因整合的假说：注入的线性DNA分子游离未端所诱导的修复酶 可能引起染色体的随机断裂，DNA未端与染色体断裂处之间相互作用使外源基因整合进基因组。,整合特征：非定点的随机整合 (DNA浓度、基因构型), 染色体断裂的概率决定了外源基因的整合率。, 染色体的断裂处就是外源的整合位点。,特点：首尾
16、串联、单一位点的多拷贝整合。 引起插入、缺失、重复、易位等 突变,插入突变:a.致死 显性.隐性; b.非致死 表型畸变或不育,因外源基因的表达，受多种因素调节，如基因结构与整合位点，与转录有关的顺式结构和反式调节因子，外源基因在宿主体内的甲基化程度及环境因素等，这些众多的因素虽难以完全控制，但在外源基因构建时，应考虑与表达相关的调控元件。,提高整合率、实现定点整合就成为转基因动物研究的关键环节。,外源基因构建及转导的研究动向,1.导入较完整的基因而不是cDNA，是获得高效表达的有效途径,2.考虑与表达相关的调控元件,启动子(Promotor)启动子是一DNA段，其典型结构应包括mRNA帽子位点，该位点是mRNA转录体实际开始的地方。指导目的基因进行转录的启动子类型是决定外源基因在体内能否稳定表达及表达率高低的关键因素。 在转基因动物研究中一般采用二类启动子。多种组织细胞中表达：如MT(金属硫蛋白) 启动子专一组织细胞中表达：如BLG(羊-乳球蛋白)启动子,
