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1、基因工程课程内容,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程概论,分子克隆单元操作,大肠杆菌基因工程,非肠道细菌基因工程,真菌基因工程,昆虫基因工程,高等动物基因工程,高等植物基因工程,蛋白质工程、途径工程,第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,用于基因克隆的载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,2.4,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,基因工程基本流程,2.1 用于基因克隆的载体,质粒载体,噬菌体或病毒载体,考斯质粒与噬菌粒,人工染色体载体,载体的基本概念,一、载体的基本概念,载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞
2、，使之传代、扩增或表达的工具。 载体的主要功能：,运载：高效运载外源基因至受体细胞内,维持：自主复制或整合至宿主基因组，以达传代目的,扩增：使外源基因拷贝数增加（克隆载体） 表达：为目的基因表达提供顺式元件（表达载体）,2、载体应具备的条件,可转移性：具有针对受体细胞的“亲缘性”或“亲和性”,可筛选性：具有合适的筛选标记,具有一定的装载能力：在插入外源基因后仍能有效转化宿主 基因文库构建需要非常大的容量,方便外源基因克隆：具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点(或多克隆位点 ),可传代性：具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,3、载体类型,克隆载体（cloning vector） 主要用
3、于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或在大肠杆菌或酿酒酵母细胞中构建基因文库。,表达载体（expression vector) 除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目的基因。,1）按功能分主要有：,3、载体类型,自主复制型载体 含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。穿梭载体 装有针对两种不同受体的复制起点，便于基因克隆,整合型载体 不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主基因组。,2）按传代特性分：,早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体 大肠杆菌-牛乳头瘤病毒 迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞
4、穿梭载体。,3、载体类型,质粒（Plasmid),噬菌体（bacteriophage)/病毒(virus) 考斯质粒（cosmid） 噬菌粒（phagemid） 人工染色体（YAC，BAC）,3）按来源分：,二、质粒(plasmid),质粒的生物学特性,质粒载体的特点与类型,几个重要的质粒载体,质粒的制备与鉴定,天然质粒,质粒载体的稳定性问题,（一）质粒的生物学特性,质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而,自主复制、并能稳定遗传的一类DNA分子。,*质粒常见于原核细菌和真菌中,*绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，,即cccDNA（covalently closed
5、 circular DNA),*质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb,大肠杆菌的质粒主要有F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）,1、质粒的自主复制性,质粒是独立的复制子（replicon）：含复制起始位点（origin, ori )和控制复制频率的调控基因 能利用宿主细胞的DNA复制系统进行自主复制,( ori ),为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低, 质粒必须控制自身的复制。在一定的生长条件下、在一定的宿主菌中, 某一质粒的拷贝数通常是一定的。,DNA的复制是由固定的起始点开始的。一般把生物体的复制单 位称为复制子（replicon）。一个复制子只
6、含一个复制起点。细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制 的，而真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复 制，也就是说它们的基因组包含有多个复制子。,质粒的复制调控：调控区紧邻ori，方便构建 调控区编码RNAI（反义）和Rop蛋白，抑制复制引物RNAII与模板结合,ori,E.coli ColE1 plasmid,复制方向,rop,（+）,Rop,RNA II（引物）,RNA I,3,5,5,3,63个氨基酸,提高RNAI的抑制,缺失会如何？,调控区编码抑制蛋白Cop，控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Co
7、p,Rep,起始因子,抑制蛋白质,如何通过质粒改造提高质粒的拷贝数？,根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒： 1 - 5 拷贝，如pSC101,松弛型复制控制的质粒： 30 - 50 拷贝，如 ColE1,氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒 迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。,2、质粒的不相容性,质粒的不相容性：在没有选择压力的情况下，任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成不相容性群,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制
8、子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,质粒的不相容性的分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，可导致子代细胞质粒组成不同，且这种差异具随机性，经过若干代后宿主细胞中处于数量弱势的质粒必然被淘汰，而仅剩强势质粒。,3、质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、部分Col、R质粒等,如Col、R的其它成员,非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生
9、接合作用,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒,的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和,mob 基因决定,4、携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得宿主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,天然质粒的改造,野生型质粒的缺点：分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想 改造策略：去掉复制和维持非必须序列；失活复制负调控序列；引入多克隆位点；引入理想的筛选标记基因,pSC101 8.
10、8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr,ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,野生质粒,选择性标记：供重组子筛选用的遗传标记基因,多克隆位点（MCS） 一段短的DNA 序列，含有多种单一限制性核酸内切酶的酶切位点，是外源基因插入的位点。,（二）质粒载体的特点与类型,质粒载体关键元件：复制起点、选择性标记、多克隆位点,复制起点：供自主复制用的由复制起始位点和调控基因组成的短序列,质粒载体的特点：,分子量小，便于操作,易于构建，可作为其他宿主系统载体的骨架,用途广泛,缺点：装载量
11、小（小于10kb），不能用来克隆大片段,（二）质粒载体的类型,人工构建的质粒载体根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列,整合质粒 装有促进整合的基因，便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选,（三）重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,1、pBR3
12、22：,氯霉素可扩增,拷贝数 50 - 100 / cell,用于基因克隆,用自己所学的知识分析该质粒 有何优缺点？,pBR322质粒载体的优点：1、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累10003000个拷贝。,抗药性标志的选择,pBR322,Amp,T
13、et,插入片段,Amp平板,Tet平板,pBR322质粒载体的改良为了更加实用，人们对pBR322质粒进行了改良，得到许多pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。,PUC质粒：人们在pBR322的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。,2、pUC18 / 19：最优秀的常规克隆载体,拷贝数 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和测序，T载体的母载体,装有多克隆位点（MCS）,含AP和正选择颜色标记 lacZ,一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）
14、； 2、氨苄青霉素抗性基因（ampr ）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。 3、大肠杆菌-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ基因； 4、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。,pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理（互补）,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,pUC质粒载体的优点第一， 具有较小的分子量和更高的拷贝数; 仅保留了pBR322的
15、氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。 第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与- 互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定。 第三，具有多克隆位点MCS区段方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。,3、T载体：克隆PCR产物用,多克隆位点中某处线性化，加装碱基T，以便和PCR产物的A互补。,pMD18-T？,MCS,T-vector两条链的3端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3端多加一个A,T-A克隆,4、pGEM：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,E.coli BL21（DE3）等,
