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1、体内药物分析,总论1.体内药物分析:药物分析的重要分支，是研究生物体中药物及其代谢物和内源性物质质与量变化规律的分析方法学。 2.体内药物存在形式:药物进入体内后，经过吸收、分布、代谢和排泄过程，其化学结构与存在状态发生变化。,绪论第一节 体内药物分析意义、性质、对象和任务一、体内药物分析的意义以往：药物质量的认识和控制只重视药物的鉴别、检查、 含量等。当今：随着药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程与药物疗效关系的进一步认识。通过分析人或动物体液及各组织器官中药物及其代谢物浓度，了解药物在体内数量和质量的变化，获得药物代谢动力学的各种参数和转变，以及代谢的方式、途径等信息，从而有助于药物的研
2、究、临床合理应用等。,（一）对象 动物和人 （二）任务 1.方法学研究：提供合理的、最佳的分析条件；评价分析方法的灵敏度、专属性、准确度、精密度等。 2.为药物体内研究提供数据 3.为临床治疗药物检测提供准确的血药浓度测定值 4.内源性物质的测定和研究 5.滥用药物的检测：麻醉、精神药品、运动员应用兴奋剂等,二、体内药物分析的对象和任务,第二节 体内药物分析的特点与要求一.体内药物分析的特点1.干扰杂质多2.样品量少在特定条件下采集，不易重新获得3.分析方法的的灵敏度和专属性要求高4.药物浓度低，有时需测代谢物5.测定方法要求简便、快速，以便为临床用药及中毒解救提供数据和情报6.实验室应具有多
3、种项目分析的设备和能力7.工作量大，数据量大，结果分析复杂,二.分析方法的要求1.高灵敏度的检测方法2.建立高选择性、高专属性的分离方法3.达到方法学要求的精密度、准确度，且 有稳定而高的回收率4.求解出有意义的参数,体内药物分析的相关基础理论概述 第一节 药物体内过程 一.药物的吸收：1.给药途径：血管内和血管外2.药物吸收的影响因素（1）药物的理化性质：脂溶性、解离度（2）药物的转运类型（3）药物的剂型（4）吸收部位的血流状况（5）给药途经,二. 药物的分布：1.药物分布的影响因素（1）药物的化学结构与理化性质（2）血流量与膜通透性（3）体内的特殊屏障A:血脑屏障 B:胎盘屏障（4）药物与
4、蛋白结合,三. 药物的生物转化：药物代谢的化学途径及部位A:主要在肝脏进行B:血液、胃肠道、肺、皮肤、肾脏等也发生,四. 药物的排泄：器官（肾脏、肝胆、肠道等）。1.肾排泄 肾脏是排泄药物和代谢物的重要器官。2.胆汁排泄 是排泄药物消除的另一重要途径。原型药物的排泄较少，代谢物排泄多。3.其他排泄途径 呼吸道、外分泌腺等,生物样品与样品制备 第一节 生物样品的种类、采集、制备与贮存 一.生物样品的种类、采集和制备1.血液1）血样的采集 A:药物在血液中分布均匀后采样B:从静脉、动脉和心脏（动物），常用的是静脉采血 C:1-5ml，动物10min；可用物理和化 学方法刺激采集C:刺激法采集优点
5、缩短采集时间；减小pH范围D:唾液样品的制备 放置分层后，3000r/min离心10min,取上清作为药物浓度测定样品 E:唾液采集特点 无痛、简便、经济,5.头发A:用于体内微量元素测定 B:可用于用药史的估计C:毒性药物的检测 6.其他体液,二.生物样本的贮存处理1.冷藏与冷冻法 生物样品量大，需要将其贮存。冷藏4C，冷 冻-20C1）血液和血清样品 采血后及时分离，不超2h，分离后冷藏 4C或冷冻-20C2）尿液样品 应立即测定，应加防腐剂后置冰箱冷藏 4C或冷冻-20C3）唾液样品 A:须测唾液pH值时，应取样后立即测定B:冷冻的样品，须解冻后测定，解冻的样品应充分搅拌一次性测完,2.
6、去活法 1）为防止采样后酶对样品成分进一步分解，需要立即终止酶的活性2）常用的方法 A:液氮中快速冷冻B:微波照射样品C:抗氧化剂D:酶活性阻断剂（三氯醋酸）E:匀浆和沉淀F:样品煮沸,第二节 生物样品的预处理和制备一 生物样品预处理的目的1.使药物从缀合物及结合物中释放出来，以便测定其总浓度2.生物样品成分复杂、干扰多、含量低。经预处理达到纯 化、富集等目的 3.为了适应和符合测定方法的灵敏度A:免疫分析法可不作预处理B:紫外、荧光分析法样品预处理十分必要,4.为了防止分析仪器的污染、劣化，提高灵敏度、准确性、精密度和选择性 生物样本中的脂肪、蛋白、不溶性颗粒等杂质污染仪器 二.样品制备时应
7、考虑的问题1.药物的理化性质和存在形式A:药物的酸碱性、未电离分子的亲脂性、挥发性B:药物光谱性及官能团C:药物在体内的存在形式及蛋白结合率,2.待测样品的浓度范围A:生物样本中药物浓度个体差异大 B:浓度高的对样品与处理要求低，低的要求高3.选用的生物样本类型A:血浆、血清清出蛋白后处理B:唾液通过离心除蛋白后萃取,C:尿液中的缀合物常用酸和酶法水解缀合物D:头发需有机破坏三.生物样品的预处理技术A:有机破坏法B:除蛋白法C:分离、纯化与浓集D:缀合物水解E:化学衍生化法1.有机破坏法 湿法破坏、干法破坏及氧瓶燃烧法1）湿法破坏A:硝酸-高氯酸 适于血、肝、尿液等破坏，测高价无机离子,B:电
8、热消化法 人发的消化C:电热板消化法 人发的消化D:烘箱消化法2）干法破坏A:高温电阻炉灰法 人发的消化B:低温等离子灰化法 人发的消化3）氧瓶燃烧法 血样和人发的消化 2.去除蛋白 测定血样时首先除蛋白A:可使结合型药物释放出来B:减少提取过程中的发泡和乳化C:保护仪器的性能，延长使用期,1）溶剂除蛋白 A:加入与水相混溶的溶剂B:蛋白聚集，结合药物释放出C:血样与溶剂体积比为1:3除90%D:操作 混合、遥均、离心、吸上清2）加入中性盐A:中性盐能将蛋白水合的水置换出来，蛋白质脱水而沉淀B:常用的盐 饱和硫酸铵等C:操作 1:2混合、离心、取上清，除90%以上蛋白3）加入强酸A:加入强酸可
9、与蛋白质阳离子形成不溶性的盐B:常用的酸 10%三氯醋酸等,C:操作 1:0.6混合、离心、取上清，除90%以上4）加入含锌或铜盐A:金属离子和蛋白分子的的带阴电荷的基团形成不溶沉淀B:常用的盐 ZnSO4-NaOHC:操作 1:（1-3）混合、离心、取上清，除90%以上蛋白5）超滤法6）其他方法A:酶水解法B:加热法,3.分离、纯化与浓集A:选择性分离是相当重要的，内源性物质、代谢物、其他共存 药物干扰分析结果B:药物处理分为两部 样品的前处理和处理后的测定C:前处理 出去介质中杂质提取出被测物，浓集被测物，达到仪器要求的检测限，提高专属性1）液-液提取法A:多数药物亲脂性的，杂质是亲水性，
10、可用有机溶剂提取B:选择溶剂考虑了解药物与溶剂的化学结构对药物未电离的分子可溶，电离分子不溶,溶剂沸点低，易挥发浓集与水不相混溶无毒，不易燃烧不易形成乳化具有较高化学稳定性和惰性不影响检测C:有机溶剂的体积 样品与提取溶剂体积比1:（1-2）D:样品溶液的pH 碱性药物最佳pH要高于pKa1-2单位酸性药物最佳pH要低于pKa1-2单位原则是酸性药物在酸性，碱性药物在碱性环境提取待测药物多为碱性的，内源杂质多为酸性的,E:如碱性药物在碱性条件下不稳定，在近中性 pH提取F:中性药物在pH7附近提取H:优点和缺点 药物可与多数的内源性物质分离有机溶剂可挥发达到浓集目的易产生乳化，降低回收率,2）
11、固相萃取（SPE）将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品通过时，由于受到“吸附”或“分配”或“离子交换”或其他亲合力作用，药物或杂质被保留在柱上，用适当流动相洗去杂质，再用适当流动相洗脱药物A:两种洗脱方式 药物比杂质与固定相之间亲和力强；杂质比药物与固定相之间亲和力强B:SPE固定相的选择固定相与被测组分具有相似的极性冲洗时改用与被测组分极性相近似的溶剂,C:SPE的种类亲脂型 大孔吸附树脂；亲脂性键合相硅胶亲水型 硅胶；硅藻土；棉纤维D:亲脂性键合相硅胶 十八烷基键合相硅胶最常用；吸附非 极性药物，易于有机溶剂洗脱,亲脂性键合相硅胶SPE注意（1）体液样品上样，体积0.1-
12、2ml，流速1-2ml/min（2）萃取碱性药物其中残存的羟基与药物的静电作用，甲醇 等很难洗脱，需加酸等（3）苯基、氰基柱有一定极性，极性药物吸附力大，用极性 溶剂洗脱亲脂性键合相硅胶SPE特点（1）方便、省时（2）洗脱溶剂量少（3）用多个柱同时萃取,I:其他SPE小柱 （1）苯基硼酸键合硅胶 选择性的萃取血浆中-拮抗剂（2）环糊精键合硅胶 选择性的萃取磺胺类（3）免疫亲和固定相 萃取生物大分子 G:离子交换树脂（1）弱酸性药物 中性或碱性下，用阴离子交换树脂萃取，甲醇清洗，酸性溶液洗脱（2）碱性药物 方法相反（3）适合高极性，可电离的药物，回收率90%以上H:亲水型填料 填料硅胶、硅藻土、
13、棉纤维（1）为分配作用（2）萃取 样品加到柱上，分布到填料表面，用水不容的有极 相洗脱亲脂性药物,F:大孔吸附树脂 （1）具有较大的表面积，适于吸附较大的分子（2）传质速度快，有不同的极性（3）使用前甲醇等除杂质，有时需用酸或碱处理 3）萃取方法的选择（1）较亲脂的药物 A:溶剂提取B:烷基键合硅胶SPE提取C:大孔树脂SPE提取D:亲水型填料SPE提取E:烷基键合硅胶SPE提取最佳，碱性药物选大孔树脂SPE提取,（2）较亲水具有酸碱性、可解离药物 A:离子交换树脂SPE小柱B:形成离子对络合物（3）亲水不能电离药物 不易萃取，可用蛋白沉淀进样法,4.化学衍生化1）光谱技术（1）紫外分光光度法
14、 紫外没有吸收或吸收小的药物（2）荧光光度法 不具天然荧光的药物（3）色谱分析法 极性大、挥发性低、热不稳定、检测灵敏度不够A:GC法中的化学衍生化法 使极性药物变成非极性的、易挥发法的药物；增加药物稳定性；提高光学异构体的分离能力主要衍生化反应硅烷化：R-OH；R-COOH；R-NH-R等极性基团药物酰化：R-OH；R-NH2；R-NH-R等极性基团药物,烷基化：R-OH；R-COOH；R-NH-R等极性基团药物生成非对应异构体衍生化法：具有光学异构体的药R（-）与（+），用不对称试剂使其生成非对应异构体衍生物，GC分析 B:HPLC法中的化学衍生化法 使极性药物变成非极性的、易挥目的：提高
15、灵敏度；提高分离度反应条件：条件严格；对某样只生成一种衍生物，副产物不 干扰测定；衍生试剂易得，通用性好种类：柱前衍生；柱后衍生紫外衍生化反应：紫外无吸收或吸收系数小，衍生化后有紫外吸收荧光衍生化反应：无荧光，衍生化后有荧光，提高灵敏度,电化学衍生化：灵敏度高；选择性强；有电化学活性药物是指药物与某些试剂反应，生成电化学活性衍生物，电化学检测器检测。带有硝基的衍生化试剂与羟、氨、羧基等化合物反应可生成电化学活性衍生物手性衍生化法：用手性衍生化试剂将药物对映体转变成相应的非对映异构体，色谱检测选择该方法的原因：不宜直接拆分；添加基团，增加色谱系统的对映异构体的选择性；提高紫外或荧光的检测效果 满足的条件：溶质分子至少有一个官能团供衍生；反应条件温和、简便、完全；生成的非对映异构体应易被裂解为原来的对映体,
