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1、液相色谱柱安装与使用,液相色谱柱安装与使用,目 录 一、液相色谱柱的安装 1 、液相色谱柱的结构 2、 色谱柱的安装 二、液相色谱柱的使用 1 、样品的前处理 2 、流动相的配制 3、 色谱柱的平衡 4、 流动相流速的选择 5、 分析方法开发中流动相调整的三原则 三、液相色谱柱的维护,色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理,色谱柱,高压泵,检测器,色谱工作站,进样器,液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。,液相色谱柱安装与使用,一、液相色谱柱的安装：1、液相色谱柱的
2、结构： （1）空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是316英寸的内螺纹(国内外已规范化)。716英寸外螺纹与14英寸柱管(6.35mm)连接，中间放置压环用于密封。316英寸的内螺纹与116英寸(1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。,液相色谱柱安装与使用,在两端柱接头内，柱管
3、两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。,液相色谱柱安装与使用,（2）柱填料：液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在310 m的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无
4、定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在310 m之间。,液相色谱柱安装与使用,2 、 色谱柱的安装： （1）拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 （2）拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。,液相色谱柱安装与使用,（3）按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力
5、插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧14-12圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧14圈，直至不漏液为止。,液相色谱柱安装与使用,二、液相色谱柱的使用： 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。,液相色谱柱安装与使用,1、样品的前处理： （1）最好使用流动相溶解样品。 （2）使用予处
6、理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 （3）使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。,液相色谱柱安装与使用,2、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： （1）流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 （2）流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。 （3）流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。,液相色谱柱安装与使用,（4 ）流动相的物化性质要与
7、使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 （5）流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 （6）在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。,液相色谱柱安装与使用,3、平衡色谱柱 反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用1020倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡“。 硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是
8、保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡,液相色谱柱安装与使用,新色谱柱的平衡方法： （1）首先用0.2ml/min的流速将色谱柱平衡过夜，然后将流速升高到1.0ml/min冲洗30分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳状态，这样可以保证色谱柱的使用寿命，并且保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性。 （2）平衡过程中，将流速缓慢地提高。 （3）用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡)。,液相色谱柱安装与使用,4、流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱
9、效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mlmin为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。,液相色谱柱安装与使用,5、 分析方法开发中流动相调整的三原则： （1）由强到弱： 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验， 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。 （2）三倍规则 ：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，
10、此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 （3）粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。先用100%的有机溶剂，再降下来。因为有些分离96%即可分离。,液相色谱柱安装与使用,6、常用洗脱剂极性大小排列表（由小到大）：石油醚环己烷四氯化碳甲苯二氯甲烷三氯甲烷乙醚甲乙酮二氧六环乙酸乙酯乙酸甲酯正丁醇丙酮正丙醇乙醇甲醇水吡啶有机酸,液相色谱柱安装与使用,7、溶剂互溶表,液相色谱柱安装与使用,三、色谱柱的维护和贮存： 1. 使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中
11、有一定的溶解度）； 2. 大多数反相色谱柱的pH稳定范围是27.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围； 3. 避免流动相组成及极性的剧烈变化； 4. 流动相使用前必须经脱气和过滤处理； 5. 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕将柱子冲洗干净，并保存在乙腈中； 6. 压力升高是需要更换预柱的信号。,液相色谱柱安装与使用,7.色谱柱贮存方法： (1)短期贮存：先用溶剂冲洗好色谱柱(如凝胶柱则用蒸馏水来冲洗) ，再把柱的两头用密封螺丝密封严。 (2)长期贮存：以色谱柱使用说明书中指定的溶剂充满色谱柱，再把柱两头用密封螺丝封严，防止溶剂挥发造成柱填料干缩，导致柱效严重降低。 (3)色谱柱
12、应贮存在4以上的室温下，如置于0以下环境里，柱内会结冰，将导致柱效降低。 (4) 警示：柱子不能贮存在水或水性溶剂中，否则会因柱内微生物滋生而导致损坏。,液相色谱柱安装与使用,8. 色谱柱的再生：(1)色谱柱使用一段时间后柱效会下降，这时可考虑对色谱柱进行再生。进行色谱柱再生时，建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵，而使用一个廉价的泵。(2)在清洗开始和结束时各测一次柱效和容量因子等，以比较色谱柱性能的改善，确定清洗的效果。(3)所用冲洗溶剂的体积应该是色谱柱体积的4060倍。确保色谱柱中没有样品和缓冲溶液，清洗前所用的溶剂应与最初清洗时所用的溶剂相溶。应确保实验测试所用的流动相与色谱柱中最
13、后的溶剂相溶。(4) a）正相填料：用四氢呋喃冲洗、用甲醇冲洗、用四氢呋喃冲洗、二氯甲烷冲洗、用无苯正己烷冲洗。b）反相填料：用HPLC级的水冲洗、冲洗时进四等份的200ul的二甲亚枫（DMSO）、用甲醇冲洗、用氯仿冲洗、用甲醇冲洗。c）阴离子交换填料：用HPLC级的水冲洗、用甲醇冲洗、用氯仿冲洗。d）阳离子交换填料：用HPLC级的水冲洗，在冲洗过程中进四等份的200ul的二甲亚枫（DMSO）、用四氢呋喃冲洗。e）蛋白质凝胶过滤填料：去除蛋白质尺寸排阻介质中的污染物有二种清洗与再生方法。弱保留蛋白质：用30mol/l pH3.0的磷酸盐缓冲液冲洗；强保留蛋白质：用100%的水到100%的乙腈梯度洗脱60分钟。,谢谢观看！,
