第17章液相色谱法

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1、1,第十七章 高效液相色谱法,17.1 概述 17.2 高效液相色谱仪 17.3 高效液相色谱法 的分类 17.4 高效液相色谱法 的应用,2,课程引入： 食品中苏丹红事件？ 水果、蔬菜中的有机磷农药残留？ “三鹿奶粉事件”中三聚氰胺的分析？,3,17-1 概述 高效液相色谱法的特点：高压、高效、高速、高灵敏度。适用于高沸点、热不稳定及生化试样的分析。,4,17-2 高效液相色谱仪,液相色谱仪（1）,5,液相色谱仪（2）,6,液相色谱仪（3）,7,液相色谱仪（4）,8,一、流程及主要部件 1.流程,HPLC与GC的原理相同，只因HPLC流动相为液体，Van.Deemter方程中，组分的纵向扩散

2、可忽略。,9,10,GC和HPLC在分离上的主要区别： GC：流动相为惰性气体，分离主要取决于组分分子与固定相间的作用力，主要通过改变固定相来改变对组分的选择性。 GLC中，流动相对组分作用极弱，一定柱温下，固定液流失主要由高柱温造成其自身挥发，所以，在应用中主要采用涂渍的方法制备柱子。 GSC中，无固定液流失现象。,11,HPLC：流动相与组分分子间有一定的亲和力；分离是由组分、流动相和固定相三者相互作用的结果。流动相是极性不同的有机溶剂或缓冲水溶液，溶解能力强。在HPLC中，固定液分子必须键合在填料上，否则，流失严重。另外，填料的颗粒直径一般为35m，柱子制备复杂。因此，在应用中，主要以改

3、变流动相来调节分离的选择性。,12,高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分：高压输液系统进样系统分离系统检测系统还配有辅助装置：梯度淋洗自动进样数据处理等,13,2.主要部件 (1)高压输液泵 压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的 固定相（10m，常用35m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。,14,高压输液泵的种类：恒压泵液压隔膜泵和气动放大泵。恒流泵螺旋注射泵和往返柱塞泵。,15,（2）梯度淋洗装置HPLC有等梯度洗脱和梯度洗脱两种。 前者保持流动相组成、配比恒定

4、。 后者采用两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按照程序连续改变流动相的浓度配比及极性。梯度淋洗的作用： 提高分离度缩短分析时间提高分析精度,16,梯度淋洗的方式： 内梯度高压梯度装置（目前广泛采用）利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。（先加压后混合）,17,外梯度 低压梯度装置通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例混合后，再用一台高压泵输入色谱柱中。（先混合后加压）,HPLC梯度淋洗改变的是流动相的配比和极，提高分离效果，缩短分离时间，改善峰形。通过改变流动相的配比和流速是HPLC中改进分离效果重要手段。GC 程序升温，改变

5、的是分析过程中的柱温。,18,(3)进样装置分为手动进样（进样器进样和阀进样）和自动进样（自动进样器进样）两种。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。,19,(4) 高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,常用： 长度为10 25cm，内径为4 5mm。,20,(5) 高效液相色谱检测器 紫外光度检测器（UV）最常用的检测器，可用于梯度洗脱。如固定波长型的汞灯254nm或280nm的紫外检测器、可调波长的氘灯或氢灯(200-400nm)。不锈钢池10L。对UV无吸收的组分不响应；对UV吸收较大，如苯不可作流动相

6、。,21,光电二极管阵列检测器（DAD）为新型的紫外吸收检测器。以氘灯为光源，绘制出随时间变化的光谱吸收曲线（A）计算机快速处理，可获得分离组分的三维彩色谱图，得到更多信息。,22,23,示差折光率检测器（RID）通用型。 每种物质具有不同的折光指数，可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。,24,荧光检测器（FD） 选择性检测器 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸等化合物有响应。,25,17-3 高效液相色谱法的类型,一、影响液相色谱分离的因素高效液相色谱中, 速率方程中

7、的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计。H = A + C u Dm10-410-5Dg,26,影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。,无随u降低H升高的现象（B/u） u降低，H降低，但无Hmin u升高，H平缓升高。因Dm10-410-5Dg,27,1.流速 流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。 降低流速，柱效提高不是很大。 但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,28,2.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱

8、的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度。研制高效柱填料是一活跃领域。,29,3.流动相及流动相的极性 可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。适合极性化合物分离。,30,若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。适合非极性化合物分离。 4.流动相组成 流动相按组成不同：分为单组分和多组分。 按极性不同：分为极性、弱极性、非极性。 按使用方式不同：分为固定组

9、成淋洗和梯度淋洗。,31,常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。,采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,32,5.选择流动相时应注意的几个问题 尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子 试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,33,二、高效液相色谱法的类型 1.吸附色谱（液-固吸附色谱LSC）以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等。较

10、常使用的是510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。常用于农药成分分离、植物色素的分离等。但不适合强极性离子型样品或同系物的分离。,34,2.分配色谱（液-液分配色谱 LLPC）通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,通过组分在固定液和固定相中的多次分配平衡进行分离。分为正相色谱和反相色谱。 正相色谱：极性固定相、弱极性或非极性流动相 分离中等极性化合物。 反相色谱：非极性固定相、以水为底剂加入少量有机溶剂的极性流动相 分离极性小的样品。,35,表面多孔型(球形玻珠)：孔浅、孔层厚度小、出峰 快、柱效高，但允许进样量小。 全多孔型(硅胶)：颗粒细、孔浅、传质快、柱效高，允

11、许进样量大，为前者的5倍。,3.化学键合相色谱（CBPC ）用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。反相CBPC：非极性固定相、极性流动相。如：ODS (C18)，甲醇-水。正相CBPC：极性固定相、非极性或弱极性流动相。如：氨基柱，正己烷。,36,18烷基键合固定相的形成ODS (C18 ),37,化学键合固定相类型：化学键合固定相是目前应用最广、性能最佳的固定相。（1）硅氧碳键型： SiOC（2）硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐 有机溶剂，应用最广。（3）硅碳键型： SiC（4）硅氮键型： SiN,38,4.离子交换色谱（IEC）固定相为离子交换树脂，流动相为无

12、机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。,39,5.凝胶色谱（空间排阻色谱）SEC （1）以凝胶为固定相。 （2）凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。 （3）利用凝胶的孔径与被分离组分分子间的相对大小关系进行分离、分析，与流动相性质无关。,40,（4）凝胶具有许多尺寸的孔径。 KD=Cs/Cm当KD=1时，为凝胶的渗透极限；当KD=0时，为凝胶的排阻极限。不同尺寸样品分子的分布系数KD总保持在0-1.0之间。,41,42,食品中苏丹红的检测,HPLC, Zo

13、rbax CN-C18,3.5um 4.6mm150mm 苏丹红为化工原料,在食品中,苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红均为10ug/Kg。,43,环境中有机氯农药残留量分析,固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流速：1.5 mL/min 色谱柱：内径 50cm2.5mm 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,44,稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇- 水100%甲醇 线性梯度淋洗， 2%/min 流速：1mL/min 柱温：50 C 柱压：70 104 Pa 检测器：UV检测器,45,三聚氰胺的结构式

14、,三氯氰胺，一种塑料化工常用材料，作为食品添加剂，并没有正当的效用。但因其一个碳原子上含有3个氮，而普通蛋白质中一个碳原子上仅含有一个氮，三氯氰胺的氮含量比蛋白质还高。,C3H6N6,46,目前，常用的测蛋白质含量方法是凯氏定氮法。通过测定氮原子含量来推算蛋白质含量。因此食品中添加此种物质，检测食品蛋白质含量时，就会误把三氯氰胺当成蛋白质，从而提高食品的蛋白质含量。由于三氯氰胺代替了真的蛋白质，这样，食品生产时，其生产成本就会大为降低。,47,48,色谱条件： Agilont TC-C18 (250mm4.6mm 5um ) 柱温：40 流速：0.8ml/min 流动相： 硫酸铵（0.02mol/L）：甲醇=94 ：6（V：V） 检测波长：215nm 进样量：10mL,