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1、1,1,第二节 原核生物DNA复制,特点 只有一个复制起始点 双向复制 复制速度快 引物和冈崎片段长 可以连续发动复制,2,2,大肠杆菌DNA聚合酶 三类 DNA聚合酶-多功能酶,5-3,3,DNA聚合酶的功能,53聚合作用 53外切酶 35外切酶活性,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补，切除引物。,4,DNApol 利用35外切活性切除错配的碱基，同时利用53聚合活性补回正确的核苷酸，这种功能称为即时校读(proof read)。,DNApol 的53外切酶作用可以与其聚合作用同时发生， 产生缺口平移(nick translation)、链的置换及模板转辙现象。,
2、5,DNApol的即时校读功能,6,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,7,5 ucgagcuag-OH 3 ,5 ucgagcuag,53聚合作用,3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5 ,3 agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc 5 ,catcggatcgcatcgtcacgtgctag 3 ,8,5,3,内切酶,外切酶,外
3、切酶与内切酶作用图解,53外切酶活性的功能,切除引物，切除突变片段,9,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,DNA聚合酶的核酸外切酶活性,10,35 外切酶活性,11,12,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。,13,功能： 原核生物复制延长中真正起催化作用的酶,DNA-pol (250kD),10种亚基组成的 不对称异源二聚体,14,可滑动的 夹持器亚基,催化亚基,35外切酶亚基,前导链 合成,后随链 合成,夹持器装置,催化亚基, 亚基保持核心酶 的
4、二聚体结构,15,亚基具有53方向合成DNA的催化活性 亚基具有35外切酶活性，起校对功能，可提高聚合酶复制DNA的保真性 亚基可能加强亚基的作用 亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住DNA分子向前滑动 亚基起着促使核心酶二聚化的作用 其余的亚基构成 -复合物，主要功能是帮助 亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用,16,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA 聚合酶,分子量 每个细胞的分子统计数 5-3 聚合酶作用 3-5 核酸外切酶作用 5-3 核酸外切酶作用 转化率 主要功能 活性（nt/min）,DNA 聚合酶,DNA聚合酶 （复合物）,109，000 400 + +
5、 + 1 校读,修复1000,120，000 40 + + - 0 .05,400，000 10-20 + + + 50 复制100000,特 性,不清 填补缺口 50,17,17,大肠杆菌基因组DNA 复制的基本过程 起始 起始部位的解链,oriC,DnaA蛋白结合9bp序列,13bp重复序列区解链,单链结合蛋白结合,形成开放复合物,18,18,局部形成引发体 DnaC、B、G和起始点DNA形成复合物，其蛋白质部分在链上移动到合适位置，根据碱基配对的原则，开始催化RNA引物的合成,19,19,复制的延伸 半不连续-前导链的连续合成，随从链合成一段段冈崎片段,20,20,复制的终止,oriC,
6、终止序列,复制叉终止区,终止序列,缠绕的环状DNA分子,拓扑异构酶II,独立的环状DNA分子,21,21,原核生物基因组DNA复制的典型模式 型复制-复制从oriC开始以顺时针和逆时针两个方向进行 主要的复制方式,22,22,原核生物DNA复制的调节 复制起始频率的调节 主要调节复制的起始频率 DnaA的浓度对复制的起始具有正调控 作用 复制频率与细胞分裂周期相适应的机制 控制复制起始点的甲基化修饰,23,亲代单链A甲基化,DNA与细胞膜结合，DNA的甲基化受到抑制,Ori C中的GATC,Dam,Seq A,子代DNA中的A被甲基化,Dam,24,24,第三节 真核生物DNA复制,1.真核生
7、物染色体DNA 复制的共同特点 复制时要解开和重新合成核小体结构 A.复制速度慢于原核生物克服核小体结构 的空间阻碍 B.组蛋白合成与DNA复制同步进行，使DNA边复制，边组装成核小体,25,25,2.多起点复制 3.RNA引物片段及冈崎片段长度小于原核生物 4.真核生物染色体复制完成后在再进行下一次的复制,26,26,真核生物染色体DNA 复制过程 复制的聚合酶和辅助因子 五种、分别起着不同的作用,27,真核生物的DNA聚合酶,28,28,复制的起始和终止 起始 复制起始点-自主复制序列，能被起始复合物识别,酵母复制起始点的结构,B3,B2,B1,A,复制起始识别序列,ARS结合因子1结合位
8、点,解链区段,起始识别复合物,ARS结合结合因子1,29,DNA聚合酶与负责的延伸,DNA聚合酶：RNA引物的合成，新的DNA链合成。 DNA聚合酶：取代DNA聚合酶，是DNA复制延长的主要酶，这个过程称为聚合酶的切换。 PNCA:增值细胞核抗原，可以与DNA聚合酶结合，增强其延伸能力。,30,30,端粒结构和端粒酶在真核生物基因组复制过程 中的作用 端粒-真核，由DNA和蛋白质组成生物染色体的末段结构端粒酶-逆转录酶，蛋白质和RNA组成，其RNA序列是复制端粒重复序列的模板，具有种属特异性,31,31,32,32,端粒结构是保持真核染色体DNA在复制过程中DNA的长度,保证染色体的稳定性.
9、端粒DNA的长度变短可以导致细胞活性下降，细胞衰老； 端粒酶活性过高，端粒DNA不停的延长，细胞不停分裂，有可能产生癌症。,33,33,线粒体DNA的复制 D环复制方式 模板双链的复制起点激活有先后，复制的结束时间不同,34,34,35,35,真核生物DNA复制的调控 细胞周期过程中的调控 在S 期进行染色体的双向复制,36,DNA合成期,哺乳动物的细胞周期,37,37,真核生物DNA复制的调控 细胞周期过程中的调控 细胞周期蛋白D 激活S期的CDK 激活复制许可因子（其此时可以从细胞浆进入细胞核，然后失活）,38,38,染色体水平调控 复制子水平的调控 与复制起始复合物的形成和RNA引物的合
10、成等的一些蛋白质和酶来共同参与复制起始位的调控,39,第四节 某些病毒基因组的复制,模板- RNA或DNA 酶- 聚合酶（ RNA或DNA）、蛋白因子 复制场所- 大部分RNA病毒（逆转录以外）在细胞质中进行 大部分DNA病毒在细胞核中 需要宿主提供复制的蛋白分子 起始的引物多样性,40,避免5-end shortent,SSB + ATP DNA 末端解链,TP,3 OH, 过程 NF NF DBP 首先结合到复制起点，然后PTP前段蛋白与聚合酶形成复合物与DNA结合，催化DNA的末端解链。,41,腺病毒 DNA 复制起始,42,43,43,反转录病毒基因组的复制 反(逆)转录酶-以RNA
11、为模板指导三磷酸脱氧核苷合成cDNA 原料: dNTP 模板: 正链RNA病毒 引物: 宿主细胞tRNA,44,逆转录酶是多功能酶，有三种酶活性：,1. 逆转录活性：即以RNA为模板合成DNA,2. RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA,3. DNA pol活性：以DNA为模板合成DNA,特点：无外切酶活性，转录错误率高2 10-4。,45,TTTT,poly A tail,CCC,3,5,3,GGG,整合入细胞基因组,逆转录活性,RNase活性,RNA:DNA杂合链,RNA模板,单链DNA,双链DNA,DNA pol活性,原病毒,tRNA提供3端羟基，与长末端序列（LTR）中的引物结合位点结合。,
