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1、布病病原学及实验室诊断,陕西省CDC鼠布生防科 安翠红,布鲁氏菌病,布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属（Brucella）的细菌侵入机体，引起传染变态反应性的人畜共患传染病。 布鲁氏菌病简称布病。 布鲁氏菌简称为布氏菌。,布病病原学及实验室检验,1,2,3,布氏菌的生物学特性,布氏菌的抗原及毒力,布病实验室检验,1.1 布氏菌的发现,1887年英国军医Bruce首先从死于“马耳他热”的英国士兵的脾脏中分离出羊种布氏菌。,1.1布鲁氏菌的分类学位置,微生物分类学家将布氏菌归为布鲁氏菌属（Brucella），下分6个种19个生物型。,分类,羊种布氏菌（Bvr.melitensis）
2、1，2，3型； 牛种布氏菌（Br.abortus）1，2，3，4，5，6，7，9型； 猪种布氏菌（Br.suis）1，2，3，4，5型； 沙漠森林鼠种布氏菌（Br.neotemae）； 绵羊附睾种布氏菌（Br.ovis）； 犬种布氏菌（Br.canis）。,陕西省布鲁氏菌病病原学调查分析,自1952年起，在人畜间共分离出3个种233株布鲁氏菌，其中羊种菌227株，占总数的97.4%。牛种3株、犬种3株。1991年以前流行优势种型为羊1、2型，1996年后则为羊1、3型 。陕西省是以羊型菌为主、牛、犬种布鲁氏菌病的混合疫区。流行优势种随时间推移发生了变化。,1.2形态和培养特征,布氏菌属的细菌是
3、一组微小的球杆状的革兰氏染色阴性菌。柯氏染色，布氏菌染成红色，其他菌染成绿色或蓝色。 宽0.30.6m，长0.61.5m。无芽孢、无鞭毛、无质粒、不形成荚膜。 一般说来，羊种菌最小，牛种菌次之，猪种菌最大。,1.2培养特性,营养条件高，生长缓慢，生长所需温度为20-40，最适温度为37 .通常要经过4-6天，有的甚至要经过20-30天（双相培养基）才能长出菌落。,1.3抵抗力,对物理因子的抵抗力 对化学因子的抵抗力 不同环境中的抵抗能力 对抗生素的敏感性,不 同 温 度 对 布 鲁 氏 菌 影响,对物理因子的抵抗力,布鲁氏菌对消毒剂的抵抗能力,对化学因子的抵抗力,不同环境中的抵抗能力,现已证明
4、，布鲁氏菌对四环素最敏感，其次是链霉素，而对枯草杆菌肽、多黏菌素B、多黏菌素M素等有很强的抵抗力。,对抗生素的敏感性,布氏菌的抗原、毒力,2,布氏菌的抗原成分十分复杂，存在A、M、G成分。A对牛种布氏菌有特异性，M对羊种布氏菌有特异性，G为两种菌共有。还与多种细菌存在共同抗原，因而有血清交叉反应。布氏菌不产生外毒素，只产生内毒素，有致热、致炎作用，可导致休克。,从种上来说，羊种毒力最强，猪种和牛种次之，犬种的毒力很弱，几乎不引起人致病。,由于菌种毒力等因素的不同，患病后的临床表现也不完全一样。羊 种布鲁氏菌的毒力最强,患者中毒症状严重，多有典型的发烧、多汗、头痛、虚弱、关节痛、肝脾及睾丸肿大等
5、急性症状。 猪种、牛种次之。 犬种的毒力很弱，几乎不引起人致病。,布氏菌实验室检验,3,诊断布病的金标准。 3.1.1实验室要求布氏菌的分离培养要在生物安全二级以上实验室中进行。 布氏菌是高致病性病原微生物，从危害程度来说为第二类病原微生物。,3.1.2方法采样（采血） 双相培养基 菌株鉴定 （菌落形态观察、涂片、染色、镜检布氏菌诊断血清玻片凝集试验） 种型鉴定（CO2需要与否、H2S的产生的测定、染料抑菌试验、单项因子血清凝集试验、噬菌体裂解试验等等）,3.1.3 布氏菌培养特性 布氏菌是需氧或微需氧菌 生长缓慢，尤其初代分离 牛种部分型别、绵羊附睾种布氏菌需在5-10% CO2环境中培养
6、新长出的菌落无色透明，光滑圆形，突起，均质，直径1-2mm 液体培养均匀混浊，无菌膜 粗糙型菌落较大，生长快,布鲁氏菌培养材料,3.1.4 布氏菌培养检查材料人或动物的全血、动物流产胎儿（胎儿的肝脏、肺、胃内容物）动物脏器、动物胎盘、关节液、阴道分泌物等新鲜乳汁,布鲁氏菌的培养,3.1.5 样品的采集 血培养：急性期、体温反应明显和血清滴度高的病人，血培养阳性率高 血培养阳性率与病期、体温反应、临床表现以及血清滴度等有关系 骨髓培养：慢性期病人骨髓培养的阳性率比血液高 从胸腔积液、脓肿和关节液、痰、乳、阴道分泌物 流产胎盘中分离到布氏菌 新鲜乳汁,布氏菌特异的油滴样菌落,布氏琼脂布鲁氏菌菌落,
7、血平皿 布氏菌菌落,布氏菌革兰染色,3.1.6布氏菌鉴定程序,分离培养 纯分离传代 玻片凝集初步鉴定，阳性血清、因子血清凝集 H2S产生试验，CO2培养依赖试验 噬菌体裂解试验 染料抑菌试验 PCR检测 其他方法检测 生化测定 脂肪酸分析 PFGE等,布氏菌噬菌体,我国1981年起从国外引进布氏菌分型噬菌体，对鉴定布氏菌有良好使用价值，可以将布氏菌鉴定到种目前使用的噬菌体有Tb Fi BK 2 Wb R R/O R/C,噬菌体对布氏菌的裂解,羊种布氏菌噬菌体裂解,分离培养基,商用培养基布氏琼脂 布氏肉汤 制备培养基肝浸液琼脂 血琼脂培养基 胰蛋白眎琼脂培养基半固体培养基 选择性培养基添加剂（多
8、种抗生素）商品添加剂多粘菌素B 杆菌肽 放线菌酮 制霉菌素注意：PH 7.2 ，琼脂适量，适当容器,布氏菌培养鉴定,新方法的应用 细菌生化 鉴定系统 PCR鉴定 OMP31AMOS-PCR,双向血培养瓶,3.2.1 血清学诊断的意义 3.2.2 针对布病进行的检验 3.2.3 血清样本的采集和保存,3.2.1 血清学诊断的意义,人的布病诊断方法：综合性诊断 （1）流行病学接触史：密切接触家畜、野生动物（观赏动物）、畜产品、布氏菌培养物等或生活在疫区内的居民 （2）临床症状和体征 （3）实验室检查：病原菌分离、试管凝集试验、补体结合试验、抗人球蛋白试验 具备（1）、（2）和（3）项中的任何一项检
9、查阳性即可确定为布病病人,3.2.2 针对布病进行的检验,实验室检查阳性判定标准 （1）病原菌分离：检出布鲁氏菌 （2）试管凝集试验：1：100（+）及以上 （3）补体结合试验：1：10（+）及以上 （4）抗人球蛋白试验：1：400（+）及以上 （5）虎红、平板凝集试验：出现可见凝集 （6）皮内变态反应：皮试后24、48小时分别各观察一次,皮肤红肿范围有一次在2.2.厘米及以上（或.平方厘米及以上）,虎红、平板凝集试验和皮内变态反应供初筛试验用 对已确诊的慢性病人和接种过菌苗的人，应以临床症状为主要依据，血清学试验效价高低，皮内变态反应强弱供参考,布氏菌的血清学诊断方法,试管凝集试验 (SAT
10、) 虎红玻片凝集试验 (RBPT) 含巯基化物处理血清后的凝集试验（2ME 试验） 抗球蛋白试验 (Coombs试验) 补体结合试验 (CFT) 乳环凝集试验 (MRT) 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 金标法 荧光偏振方法 （FPA）,3.2.2.1、虎红玻片凝集实验,原理：利用酸性带色的抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性，主要检查血清中的IgG类抗体。 评价：简便快速、容易操作，适用于基层大面积检疫，容易出现假阳性，结果仅供参考，不能作为确诊依据。,布病虎红玻片凝集试剂,试剂与器材,虎红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂玻片、微量移液器、枪头。 方法：在玻片上加0.0
11、3ml被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03ml，充分混匀，5min之内观察结果。 结果判定：出现可见的凝集反应就判为阳性；否则就为阴性。 评价：简便快速、容易操作，漏检率极低，适用于基层大面积检疫；容易出现假阳性，临床上需要借助SAT来确认。,注意事项,血清静止的温度和时间对实验结果有很大的影响，在一定的时间和温度范围内，防治时间越长，温度越高，假阳性率越低； 患者空腹血清出现假阳性少； 凡是试验中凝集颗粒不规则，大小不匀，片状或絮状，凝集不清澈者，一般为假阳性，否则凝集颗粒规则，大小均匀，凝集清澈者，一般与SAT结果相符，为阳性。,原理：布氏菌侵入机体后，就会刺激机体产生特异性抗体，这种抗
12、体可与相应的布氏菌抗原发生特异性结合，在电解质的作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，也就是用已知抗原查未知抗体。,3.2.2.2、 试管凝集试验,3.2.2.2、 试管凝集试验,试管凝集试验 阴性,布氏菌试管凝集 阳性,布氏菌试管凝集抗原,器材与试剂,实验凝集抗原、被检血清、生理盐水 移液器、吸管、凝集管、试管架、稀释抗原用的玻璃杯、37度温箱。 方法：每份血清取9支小试管，放于试管架上。 血清稀释稀释抗原后；加入抗原温育18-22小时室温放置2小时后观察结果 比浊管配置,0.2ml血清,2.3ml盐水,0.5ml抗原,05ml弃去,1:1600,结果判定：根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反
13、应程度（滴度），特别是50%清亮度（+）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。 + 液体完全透明，菌体成伞状沉淀或块状颗粒状沉淀，呈100%凝集。 + 液体近于完全透明，菌体成伞状沉淀，呈75%凝集。 + 液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈50%凝集。 + 液体不透明，管底有很不明显的伞状沉淀，呈25%凝集。 液体不透明，无伞状沉淀。 效价以产生50%凝集的血清最高稀释倍数为受检血清的效价。 血清对照为清亮透明无沉淀，抗原对照为均匀浑浊，两种对照管成立，才可判定试验管，否则重做。人的诊断标准：1:100+为阳性，1:50+为可疑。,试管凝集实验的评价,实验室诊断标准之一 滴度1100及
14、以上或病程一年以上者滴度为150及以上为阳性 特异好，实用性、敏感性强 主要检查血清中的IgG和IgM，适合于急性期病人的诊断。 缺点：有前带现象，有时出现假阴性结果；长生一定的交叉反应；出结果慢，需要两天,注意事项,受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温度不能超过10，采血后应于3-4日内进行检查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低。 每份血清和抗原要有对照。 个别血清会出现前带现象，建议多做几个管，多采用几个稀释度。,3.2.2.3、抗人球蛋白实验（Coombs）,原理：机体受布氏菌抗原刺激后可产生“完全抗体”和“不完全抗体”。不完全抗体可与相应抗原结合，但不出现可见反应。若将预测
15、不完全抗体的人血清球蛋白作为抗原，注射于另一种动物（常用家兔）制成抗球蛋白（抗IgG、IgA、IgM）的抗体，再将此球蛋白抗体加入到抗原与不完全抗体复合体中，即可出现可见反应。分为两个阶段: 不完全抗体与相应抗原结合为不可见阶段 抗原抗体复合物有抗球蛋白抗体凝集而形成可见反应 评价：所查抗体主要是IgG、IgA；可以作为早期和追溯诊断；适用于亚急性和慢性病人；操作复杂，耗时长，一般不作为常规检查项目。,器材及试剂,试剂：试管凝集抗原、被检血清、抗被检对象的血清球蛋白抗体、生理盐水 器材：普通离心机、温箱、1ml及10ml吸管。 方法：试管凝集试验阶段抗球蛋白反应阶段 吸取上项试验的可疑管和全部
16、阴性管，4000转/分离心15分钟，反复洗涤3次。向各管中加入生理盐水0.5ml，混匀，再向各管中加0.5ml一定稀释度的抗球蛋白血清，将反应管置37温箱中20-22小时，取出室温放置2小时后判定结果。 判定标准同试管凝集试验,对照,被检血清对照（被检血清+盐水） 试管凝集抗原对照（试管抗原+盐水） 抗球蛋白血清加生理盐水对照 抗球蛋白血清加试管凝集抗原对照 抗球蛋白血清加被检血清对照 对照全部为阴性时，实验才有意义 我国试行的用于诊断人布病标准1:400及以上滴度。,注意事项,在进行Coombs试验时，洗涤抗原很重要，如不认真洗涤，在抗原表面上吸附血清中的某些其他蛋白物质，会干扰下一步加入抗球蛋白血清的反应，掩盖真正结果。 一般采用加入抗球蛋白血清1:20-1:50之间的稀释度。,评价,（1）布氏菌感染后，约在15天出现不完全抗体，3个月左右达到高峰。可持续一年左右。该实验可作为早期和追溯诊断。 （2）该试验特异性较强，尤其适用于诊断亚急性和慢性病人，所查抗体主要为IgG、IgA类。 （3）一般不作为常规项目，在试管凝集试验为可疑，患者又处于慢性期时，可考虑抗球蛋白试验予以诊断。,
