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1、1 调整期：细菌代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP以及其他细胞成分 2 对数期：细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比 较稳定 （调整期和对数期的细菌几乎不存在种内斗争） 3 稳定期：有害代谢产物积累，新增细胞数目与死亡 细胞数目达到动态平衡，次级代谢产物大量积累，形成芽孢 （稳定期的细菌种内斗争最激烈） 4 衰亡期：细菌数目急剧下降，出现畸形细菌 （衰亡期的细菌和无机环境的斗争最激烈）,基因组文库的构建步骤,1、从组织或细胞提取基因组DNA； 2、用限制性酶部分水解成适当长度的DNA片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA片段； 3、通常采用噬菌体或柯斯质粒载体等容载量较大的克隆
2、载体，在适当位点将载体切开； 4、将基因组DNA片段与载体进行体外连接； 5、重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。,cDNA文库的构建步骤, 从生物体或细胞中提取mRNA ； 利用逆转录酶以寡聚核苷酸为引物合成cDNA的一条链； 利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链； cDNA与载体的体外连接； 噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。,动物细胞培养基种类和组成,动物血清的作用,提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素； 提供有利于细胞贴壁所需的贴壁因子和生
3、长因子； 提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白； 提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素； 提供良好的pH缓冲系统。,葡萄糖氧化酶催化葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和H2O2，生成的H2O2在过氧化物酶的作用下分解为水和原子氧，新生态的原子氧将无色的还原型邻联苯甲胺氧化成蓝色物质。颜色的深浅与样品中葡萄糖浓度成正比。随着样品中葡萄糖浓度的增加，酶试纸的颜色由粉红一紫红一紫色一蓝色，不断加深。其反应过程如下：,此酶试纸已在临床中用以测定血液或尿液中的葡萄糖含量，以诊断糖尿病。,酶偶联法检测葡萄糖原理,利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反
4、应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。,发酵工程制药的定义,1、微生物菌体的发酵,SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等） 生物防治制剂（如苏云金杆菌） 活性乳制剂,细胞的生长与产物的积累成平行关系， 生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段。,微生物发酵类型,2、微生物酶发酵,各种酶制剂： 糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等 天冬酰胺酶： 抗癌 纳豆激酶、链激酶： 治疗血栓 青霉素酰化酶：青霉素生产,需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。,3、微生物代谢产物发酵,初级代谢产物： 与菌体生
5、长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的 氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累,次级代谢产物： 与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成 抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等 结构较复杂，对环境条件敏感,4、微生物转化发酵,利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。,反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性。,如：甾体转化,可的松（Cortisone）,药用发酵产品分类,生物来源,作用对象,作用机制,化学结构,细菌 真菌 放线菌,抗菌药 抗肿瘤药 抗
6、病毒药 除草剂 酶抑制剂 免疫调节剂,抑制细胞壁合成药 影响细胞膜功能药 干扰蛋白质合成药 抑制核酸合成药 抑制生物能量反应药,抗生素 维生素 氨基酸 核苷酸 甾体激素 酶及酶抑制剂,发展趋势,利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、新的工程菌和新型微生物的开发； 新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、白介素、促红细胞生成素等； 新型菌体制剂和疫苗。,红细胞生成素 ( 治疗贫血) 生长激素 ( 促进生长) 胰岛素 (治疗糖尿病) 干扰素 (抗病毒、抗肿瘤),发酵菌种的选育要求,生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少。 操作性：培养条件简单，发酵易控制
7、，产品易分离。 稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化。 安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素。,从自然界中获得新菌种,土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等 基本程序：采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株 诱变育种 物理或化学方法诱发突变。 物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等 化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等,杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换。 原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换。 基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广。 菌种保藏(Culture conservation)
8、目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。,菌种保藏三要素,典型菌种的优良纯种的休眠体； 创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）； 尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。,菌种保藏的常用方法,斜面低温保藏法 石蜡油封存法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法,1、分批培养的定义,分批培养是一种间歇式的培养方法，在每一批次的培养过程中，不再加入其它营养物料。待生物反应进行到一定程度之后，将全部培养液倒出、进行后道工序处理。,为了提高生物反应器在分批培养中的效率 通常采
9、用多级分批培养的办法。 即在小型生物反应器中接入少量种子 经过分批培养，来获得较大数量的细胞作为种子 再转入到大型生物反应器中,分批培养的设备要求较少 操作也较简单 工业微生物生产中经常采用,3、分批培养中影响细胞生长的因素,共有以下5种影响因素： （1）营养物质浓度 （2）温度 （3）pH值 （4）溶解氧浓度 （5）产物 （1）营养物质浓度营养物质的限制性浓度-当某一种营养物质的浓度下降到一定程度之后，就会影响细菌的生长，此时的浓度就称为营养物质的限制性浓度。 营养物质的最大浓度-当某一种营养物质的浓度超过一定程度之后，也会对细菌的生长产生抑制作用。,（2）温度,当培养温度偏低时，细胞的生长
10、速率较低， 随着温度的升高，细菌的生长速率也随之加快， 当温度超出一定范围时，由于蛋白质等细胞结构的变性，导致细菌生长速率的急速下降。,微生物细胞的最适生长温度并不等于其代谢产物的最佳生产温度。 因此在具体的生产过程中， 培养的前期常常将温度调控在有利于细胞生长的区域， 而在后期则常常将温度转到最佳的生产温度， 以获得较多的产物,根据培养温度的要求的不同，可以将微生物分成：低温菌，中温菌，高温菌。 采用高温菌生产有许多优点： （1）高温菌所生产出的酶，其热稳定性较好。 （2）高温菌的培养温度较高，细胞的生长速率较大。 （3）不容易发生杂菌污染。 （4）在大规模生产时可以节约冷却水、同时能够减少
11、动力消耗。,发酵温度调控技术,（3）pH值,细菌适宜于在中性、弱碱性的条件下生长。 酵母菌、霉菌则喜酸性环境。 乳酸菌、醋酸菌对于低PH值环境有着很好的耐受性。 （4）溶解氧浓度 不同的培养过程对于溶解氧有着不同的要求 应该根据具体情况来加以控制。,（5）代谢产物的抑制作用,细胞的代谢产物会影响到细胞的生长，这种现象称作产物抑制作用。 而代谢产物多数就是生物制物的原材料。 因此，在实际生产过程中要设法定期收集细胞的代谢产物,1、连续培养方法的优点 （1）细胞生长速率较高。 （2）连续培养可发使得培养液达到一个稳定状态,2、连续培养方法的缺点 （1）连续培养延续的时间长，发生杂菌污染的概率也就增
12、加 （2）长时期进行连续培养，细胞发生变异、质粒丢失、基因突变、 （3）细菌株生产性能退化的现象也就比较突出,（1）单级连续培养,新鲜培养基的加入速率=培养之后的物料抽出速率。这种培养方法称为单级连续培养法。 在单级连续培养方法之中，发酵液体积保持恒定，生物反应器中各组分分布均匀。 单级连续培养是一种最简单的连续培养方法。,（2）细胞回流式的单级连续培养,将单级连续培养流出液中的细胞加以浓缩，然后再送回到生物反应器中，这种方法称为细胞回流式的单级连续培养。 细胞回流式的单级连续培养相当于不断地对生物反应器进行接种，有利于提高连续培养的效率。,（3）多级连续培养,将几个生物反应器串联起来，第一个
13、反应器的流出液作为第二个反应器的流入液，第二个反应器的流出液又作为第三个反应器的流入液，这种培养方式就称为多级连续培养法。,1、补料分批培养,补料分批培养法是介于分批培养和连续培养之间的一种操作方法。是指在进行分批培养中间，向生物反应器中加入营养物质进行补料，但同时不取出培养液的方法。,由于补料，使得培养液的体积逐渐扩大， 到一定时间之后，再将培养液从反应器中一次性放出。,（1）方法改良,连续补料分批培养法在进行补料分批培养时，如果所取出的培养液数量少于补进的物料数量，反复进行多次的放料和补料操作，这种方法称为连续补料分批培养。,（2）补料分批培养的优点,（1）通过流加高浓度的营养物质， 培养罐内的细胞浓度可以达到非常高的程度 这对于细胞产物的生产十分有利,（3）通过补料，能够解除某些营养物的低浓度限制效应 提高产物的合成效率。,（2）通过补料和放料的连续进行， 能够解除某些基质、产物对细胞的抑制作用,发酵设备发酵罐,发酵罐的特点 轴封严密，泄漏少 能承受一定压力、温度 搅拌通风装置保证气液充分混合 具有足够的冷却面积 死角少，灭菌彻底 适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）,培养基的灭菌 空罐灭菌 实罐灭菌 连续灭菌 发酵过程中的中间分析项目 产物产量 pH 糖 氨基氮 菌丝形态,
