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1、,生姜蛋白酶的大分子结合修饰,作者：刘恩岐，张建萍，贺菊萍文章来源：生物谷,报告人：西安交通大学 10122004申世红,生姜及生姜蛋白酶的简介,生姜蛋白酶：是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。应用： 医药工业；食品工业；日化工业；饲料工业；皮革工业,生姜蛋白酶,生姜及生姜蛋白酶的简介,文章背景知识：1.天然生姜中蛋白酶的缺点：稳定性差、失活快，限制了生姜蛋白酶在生产中的推广应用。2.修饰方法：大分子结合修饰是目前应用最广的酶蛋白修饰方法之一，对提高酶活力、增强稳定性具有
2、显著效果。 3.常用的修饰剂：聚乙二醇：聚乙二醇(PEG)是一种线性、无毒且不带电的水溶性大分子。右旋糖苷：由D- 葡萄糖通过-1,6 糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性 。,文章结构,文章结构,材料与试剂：生姜（市售鲜生姜）；单甲氧基聚乙二醇(mPEG5000)；右旋糖苷(dextran40000)；三聚氯氰(C3Cl3N3)；高碘酸钠；2,4,6- 三硝基苯磺酸 (TNBS)；硼氢化钠；聚乙二醇(PEG20000) 仪器与设备：PHS-3C 精密pH 计；THZ-82 型数显式电热恒温水浴锅厂；HJ-3 型数显恒温磁力搅拌器；TU-1810 紫外- 可见分光光度计 L
3、GJ-18A 型冷冻干燥机,第一部分：材料与方法,方法：生姜蛋白酶的制备：1.将新鲜生姜洗净、切丁，每1kg 生姜加入4预冷的磷酸缓冲液2L。用高速组织捣碎机搅碎制成匀浆，离心弃渣取上清液。2.将离心姜液进行超滤处理，得到相对分子质量大于10000、小于50000 的生姜蛋白酶浓缩液。将生姜蛋白酶浓缩液与4预冷的丙酮按一定的比例混合（数据来源于本文参考文献），离心弃上清液，取沉淀自然风干，制得生姜蛋白酶粗粉。3.将生姜蛋白酶粗粉用磷酸缓冲液溶解后，经葡聚糖凝胶G-200 和二乙氨基乙基纤维素DE52 进行两次柱层析纯化，透析脱盐后经冷冻干燥得到生姜蛋白酶纯品,第一部分：材料与方法,生姜蛋白酶活
4、力的测定 原理：生姜蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，在碱性环境下，酪氨酸与福林试剂作用产生有色物质，于波长660nm 处进行光密度(OD)测定。光密度与酪氨酸的浓度成正比。酪氨酸的量来表示生姜蛋白酶分解蛋白质的能力。 （在这里笔者定义：在40、pH6.0 条件下，每分钟水解酪蛋白产生1g 酪氨酸，定义为1 个蛋白酶活力单位。具体测定方法参见SB/T 10317 1999蛋白酶活力测定法。）,材料与方法：生姜蛋白酶酶活力测定,单甲氧基聚乙二醇对生姜蛋白酶的修饰 单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的活化：采用三聚氯氰活化法7-8（此处笔者仅提供了参考文献） 活化mPEG 化学修饰生姜蛋白酶的制备：在酶液质量
5、浓度为2.0mg/mL 的生姜蛋白酶硼酸缓冲液中，加入一定比例的活化mPEG 修饰剂，于40水浴中保温反应lh;磷酸缓冲液(0.lmol/L，pH7.0)中透析24h，用截留相对分子质量为10000 的超滤膜超滤，截留浓缩液，冷冻干燥即得mPEG 修饰的生姜蛋白酶。通过酶修饰率和修饰酶的活力测定，探讨活化mPEG 的用量和pH 值对修饰效果的影响。,材料与方法：单甲氧基聚乙二醇对生姜蛋白酶的修饰,材料与方法：右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰,右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰 右旋糖苷的活化:采用高碘酸钠活化法（此处笔者仅提供了参考文献） 活化右旋糖苷化学修饰生姜蛋白酶的制备：在酶液质量浓度为2.0mg/m
6、L 的生姜蛋白酶硼酸缓冲液中，加入一定比例的活化右旋糖苷修饰剂，于40水浴中保温反应lh，添加NaBH4(50mg/mL)终止反应。调pH 值至7.0，对水透析4h，再用PEG20000 反透析浓缩后，冷冻干燥即得修饰的生姜蛋白酶12。通过酶修饰率和修饰酶的活力测定，探讨活化右旋糖苷的用量和pH 值对修饰效果的影响。,酶修饰率的测定,酶修饰率的测定： 方法：采用TNBS 法； 原理：酶蛋白表面的游离氨基与过量的2,4,6- 三硝基苯磺酸(TNBS)反应，生成三硝基苯酚的衍生物，在335nm 波长处有最大吸收峰。 过程：取1mL 含1mg 生姜蛋白酶的溶液，加入1mL 质量分数为4%、pH8.5
7、 的碳酸氢钠溶液和1mL 质量分数为10% 的十二烷基磺酸钠溶液，20min 后加入1mL 质量分数为0.1% 的2,4,6- 三硝基苯磺酸(TNBS)溶液，40保温2h；,酶修饰率的测定,酶修饰率的测定： 过程：335nm 波长处测定吸光度。同样浓度的酶液在修饰反应后与反应前吸光度之比即为残留氨基量。 数据处理:式中：A1 为酶液修饰反应前吸光度；A2 为酶液修饰反应后的吸光度。,第二部分：结果与分析,活化mPEG 对生姜蛋白酶修饰条件的筛选 活化mPEG 用量对生姜蛋白酶修饰效果的影响在酶液质量浓度为2.0mg/mL、pH9.0 硼酸缓冲液中，于40条件下修饰反应lh，活化mPEG 用量对
8、生姜蛋白酶的修饰率和相对酶活力(修 饰酶活力/ 天然酶活力)的影响见表1,第二部分：结果与分析,活化mPEG 用量对生姜蛋白酶修饰效果的影响,图表分析：mPEG 和酶的比例决定了氨基修饰率的大小，随着活化mPEG 加入量的增加，生姜蛋白酶的修饰率呈上升趋势，酶活力呈下降趋势。当mPEG 与酶的质量比为17.5:1.0 时，酶修饰率为51.3%，酶活回收率(相对酶活力)为52.2%，再增加mPEG 的量，修饰率不再增加，酶的活力也几乎没有变化，因此选择mPEG与酶质量比为17.5:1.0 作为生姜蛋白酶化学修饰较佳的mPEG 用量。,第二部分：结果与分析,活化mPEG 对生姜蛋白酶修饰条件的筛选
9、 pH 值对mPEG 修饰生姜蛋白酶效果的影响在1.0mL 酶液质量浓度为2.0mg/mL 的硼酸缓冲液中加入35mg 活力化的mPEG，不同pH 值条件对生姜蛋白酶的修饰率和相对酶活力的影响见表2。,第二部分：结果与分析,pH 值对mPEG 修饰生姜蛋白酶效果的影响,图表分析：随着pH 值的增大，生姜蛋白酶的修饰率增大，相对酶活力也在增大，但是当pH 值达到10.0 时，酶修饰率与相对酶活力反而有所下降。说明酶分子对环境的pH 值敏感。其原因为：pH 值能引起酶分子中可离解极性基团的离解状态和电荷改变，不仅影响修饰效果，也改变了未修饰酶的构型和构象，从而影响了酶活性。在pH9.0 时，酶修饰
10、率和相对酶活力均较高，因此选择pH9.0 为最佳修饰pH 值。,第二部分：结果与分析,活化右旋糖苷对生姜蛋白酶修饰条件的筛选 活化右旋糖苷用量对生姜蛋白酶修饰效果的影响在酶液质量浓度为2.0mg/mL、pH6.0 硼酸缓冲液中，于40条件下修饰反应lh，活化右旋糖苷用量对生姜蛋白酶的修饰率和相对酶活力的影响见表3,第二部分：结果与分析,活化右旋糖苷用量对生姜蛋白酶修饰效果的影响,图表分析：随右旋糖苷修饰剂用量的增加，修饰率和相对酶活力均呈上升趋势，当右旋糖苷与酶质量比为42:1 时，生姜蛋白酶氨基修饰率为50.8%，相对酶活力为328%，再增加右旋糖苷的量，修饰率和酶的活力均有所降低因此选择右
11、旋糖苷与酶质量比为42:1 作为生姜蛋白酶化学修饰较佳的右旋糖苷用量。,第二部分：结果与分析,活化右旋糖苷用量对生姜蛋白酶修饰效果的影响 pH 值对右旋糖苷修饰生姜蛋白酶效果的影响在1.0mL 酶液质量浓度为2.0mg/mL 的硼酸缓冲液中加入84mg 活化的右旋糖苷，不同pH 值条件对生姜蛋白酶的修饰率和相对酶活力的影响见表4。,第二部分：结果与分析,pH 值对右旋糖苷修饰生姜蛋白酶效果的影响,图表分析：在pH 值中性至碱性的情况下，右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰率呈明显降低的趋势；在pH 值偏酸性的条件下，修饰率和相对酶活力均较高；在pH6.0 时，酶修饰率为52.3%，修饰酶活性是天然酶的3
12、.3 倍；因此选择pH6.0 为最佳修饰pH 值。,第二部分：结果与分析,mPEG 和右旋糖苷对生姜蛋白酶修饰效果的比较在实验确定的较佳修饰条件下，活化的mPEG 和右旋糖苷对生姜蛋白酶修饰效果的比较见表5,结论：两种修饰剂对生姜蛋白酶的修饰率接近，均52% 左右；mPEG 修饰酶的残留相对酶活力为54.0%，右旋糖苷修饰酶的活性是天然酶的3.3 倍，所以右旋糖苷对生姜蛋白酶修饰效果较好。,第二部分：结果与分析,修饰酶与天然酶热稳定性的比较 研究方法：将mPEG 修饰酶、右旋糖苷修饰酶与天然酶分别在40、60和80条件下保温10、30min 和60min，然后测定不同热处理时间的相对酶活力。生
13、姜蛋白酶天然酶与两种修饰酶热稳定性的比较结果见表6。注：天然酶活力为106.3U/mg，相对酶活力/%=(不同热处理残留酶活力/106.3) 100；mPEG 修饰酶活力为55.6U/mg，相对酶活力/%=(不同热处理残留酶活/55.6) 100；右旋糖苷修饰酶活力为317.5U/mg，相对酶活/%=(不同热处理残留酶活力/317.5) 100。,第二部分：结果与分析,修饰酶与天然酶热稳定性的比较,第二部分：结果与分析,修饰酶与天然酶热稳定性的比较,图表分析：随着温度的升高和加热时间的延长，天然酶和修饰酶的酶活力都在不同幅度地下降。相同热处理条件下，修饰酶的活力相对于天然酶活力下降比较缓慢，热
14、稳定性均比天然酶高；右旋糖苷修饰酶又比mPEG 修饰酶的相对酶活力下降慢、热稳定性高。由在80条件下热处理60min的数据得右旋糖苷修饰酶的残留相对酶活力是天然酶的1.9 倍，是mPEG 修饰酶的1.2 倍，右旋糖苷修饰酶的热稳定性优于mPEG 修饰酶。,第三部分：结论,结论 取1mL 含1mg 生姜蛋白酶的溶液，加入1mL 质量分数为4%、pH8.5 的碳酸氢钠溶液和1mL 质量分数为10% 的十二烷基磺酸钠溶液，20min 后加入1mL 质量分数为0.1% 的2,4,6- 三硝基苯磺酸(TNBS)溶液，40保温2h； 两种修饰酶的热稳定性均比天然酶显著增强，且右旋糖苷修饰酶的热稳定性明显高于mPEG 修饰酶。 在本实验优化得出的修饰反应条件下，右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰效果优于聚乙二醇，适合应用于提高酶活性和稳定性的化学修饰与新型酶制剂的开发利用等领域。,谢谢大家！,
