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1、紫外可见分光光度法,原理、应用及有关注意事项 第一节 概述 紫外可见分光光度（UVVIS)法是一种常用的检验方法，它是通过被测物质在紫外光区的特定波长或一定波长范围内的吸光度，对该物质进行定性和定量分析的方法。,紫外光谱是物质在200400 nm的近紫外光区和400850 nm的可见光区的吸收光谱。通常使用的紫外可见分光光度计的工作波长范围为190900nm,本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。适用于微量和痕量组分的分析，测定灵敏度可达到10-410-7g/ml或更低范围。,第二节 原理,紫外分光光度法之所以能成为一种分析方法，主要依据两点： 一、就是我们常说的吸收度，2005
2、年版药典已将它改为吸光度，这样说可能更准确些。就是物质对光的吸收程度。我们首先说一下电磁波，所有电磁波在性质上都完全相同的，他们之间的区别仅在于波长或频率的不同。,按照波长排列从短到长依次为r射线、x射线、紫外线、可见光、红外线、微波、无线电波等。电磁辐射源与物质作用时，会与物质间产生能量交换。按物质和辐射能的转换方向，光谱法可分为吸收光谱法和发射光谱法两大类。电磁辐射源照射试样时，其原子或分子选择吸收某些具有适宜能量的光子，使相应波长位置出现吸收线或吸收带，所构成的光谱为吸收光谱。,利用物质的吸收光谱进行定量、定性及结构分析的方法称为吸收光谱分析法。紫外可见吸收光谱是一种分子吸收光谱，它是由
3、于分子中原子的外层电子跃迁而产生的。,因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱有称为电子光谱。在不同的波长下测定物质对光吸收的程度（吸光度），以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，所绘制的曲线称为吸收光谱，测定的波长范围在紫外可见区，称紫外可见光谱，简称紫外光谱。,由上图可以看出吸收光谱的特征： 曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以max表示。 曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，所对应的波长，称最小吸收波长，以min 表示。 曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，形状像肩的部位，称肩峰，以sh表示。 在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰
4、形，此处称为末端吸收。,二、Beer-lambere定律，它是描述物质对单色光吸收强弱与吸光物质的厚度和浓度间关系的定律。 数学表达式为A=ELC A为吸光度，吸光度与浓度或厚度之间是正比关系，其中E是比例常数，称为吸光系数。 正是由于Beer-lambere定律的发现，吸光度才与物质的浓度联系起来，紫外分光光度法才应用于物质的测定。,第三节 应用 上面简单讲了紫外分光光度法的工作原理，下面系统讲一下紫外分光光度法的应用，主要讲一下它在药品检验中各种用途。 某些物质的吸收光谱上可出现几个吸收峰，不同的物质有不同的吸收峰。同一物质的吸收光谱有相同的max，min ，sh ；而且同一物质相同溶度的
5、吸收曲线应相互重合。这句话揭示了紫外分光光度法的应用依据。 应用主要分四个方面：,第一：药品的定性鉴别 定性鉴别具体又分三个方法 比较光谱一致性 吸收光谱中，max、min、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照。（对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。溶剂可能会影响整个光谱的形状，比如多潘立酮片紫外鉴别时用开封的异丙醇所分析的光谱形状就与天津的试剂不一致。）,采用紫外光谱进行定性鉴别有一定的局限性，由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，在成千上万种
6、有机化合物中，不同的化合物可有相似的吸收光谱，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，为进一步确证，可换一种溶剂或采用不同酸碱性的溶剂，再分别把对照品和样品配成溶液测定光谱作比较。 如果两种纯化合物的紫外光谱明显差别时，则可以肯定两种化合物不是同一物质。 对比吸收光谱特征数据的一致性,最常用于鉴别的光谱特征数据有吸收峰（max）和峰值吸光系数（max或E1%1cm），这是因为峰值吸光系数大，测定灵敏度较高，且吸收峰处与相邻的波长处吸光系数值的变化较小，测量吸光度时受波长变动影响较
7、小，可减少误差。不只1个吸收峰的化合物，可同时用几个峰值做鉴别依据。（如药检所去年以来检的创可贴，就是在257nm、262nm、269nm三个波长处测定最大吸收，规定三个波长处都应有最大吸收，没有最大吸收就可以判定为假药）。,肩峰或吸收谷处的吸光度测定受波长变动影响也较小，有时也可用谷值、肩峰值与峰值同时作鉴别依据。（比如甲硝唑片的第三个鉴别就是分别在277 nm和241 nm的波长处分别测最大吸收和最小吸收。） 具有不同吸光基团的化合物可有相同的最大吸收波长，但它们的摩尔吸光系数常有明显的差别，所以摩尔吸光系数常用于分子结构分析中吸光基团的鉴别。对于分子中含有相同吸光基团的物质，他们的摩尔吸
8、光系数常很接近，但可因相对分子质量不同，使百分吸光系数的值差别较大，可以用百分吸光系数作为鉴别的依据。（比如结构相似的甲基睾丸酮和丙酸睾丸素在无水乙醇中的最大吸收波长max都在240nm，但在该波长处的E1%1cm数值，前者为540，而后者为460，因而有较大的鉴别意义）。 （摩尔吸光系数的意义是在一定的波长下，溶液浓度为1mol/L厚度为1cm时的吸光度。百分吸光系数，又称比吸光系数，只在一定波长下，溶液浓度为1（W/V）厚度为1cm时的吸光度。）,对比吸光度比值的一致性 有时物质的吸收峰较多，可规定在几个吸收峰处吸光度或吸光系数的比值作为鉴别标准。（比如维生素B12注射液的鉴别，规定应在3
9、61nm与550nm的波长处有最大吸收；361nm波长处的吸光度与550nm波长处的吸光度的比值应为3.153.45）。 如果被测物质的吸收峰和对照品的相同，且峰处吸光度或吸光系数的比值又在规定范围之内，则可考虑被测样品与对照品分子结构基本相同。,第二：药品的纯度检测 纯度检测又分为杂质检查和杂质限量检测。 杂质检查 若该物质本身在紫外光区无吸收，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处该物质无吸收，则可用本法作杂质检查。（例如，乙醇中可能含有苯的杂质，苯的max为256nm，而乙醇在此波长处几乎无吸收，乙醇中含苯量低达0.001，也能从光谱中检查出来，这个应用前景很广阔。）,若化
10、合物在某波长处有强的吸收峰，而所含杂质在该波长处无吸收或吸收很弱，则化合物的吸光系数将降低，若杂质在该波长有比此化合物更强的吸收，将会使化合物的吸光系数增大，且会使化合物的吸收光谱变形。（举一个间接的例子吧，前一段时间快检车抽到一批吗叮啉，红外快检认定是假药，送到所里以后，我们用薄层法做了一下，发现样品也显斑点，位置基本一致，而且斑点很大，按说可以认定样品不假，慎重其间，我们就有作了一个紫外鉴别，发现它在288nm处没有最大吸收，而在240nm处有很强的吸收，紫外图谱和标准品差异明显，最后认定为假药）。,杂质限量检测 限度 药品纯与否是相对的，要想制得一个纯品，所花费得成本很高，对于我们常用的
11、药品来说，纯品意义不大，所以药典就规定了一个允许杂质存在的限度，就是杂质限量。紫外常用来检测杂质限量。例如肾上腺素在合成过程中有一个中间体肾上腺酮，当它还原成肾上腺素时，反应不够完全而带入产品中，成为肾上腺素的杂质，影响肾上腺素的疗效。因此，肾上腺酮的量必须规定在杂质限量之下。在310nm处，肾上腺酮有最大吸收，而肾上腺素则几乎没有吸收，因此，测定肾上腺素盐酸溶液在310nm波长处的吸光度，可检测肾上腺酮的混入量。（具体方法为将肾上腺素用（9-2000）的盐酸制成2.0mg/ml的溶液，在310nm的波长处测定，吸光度不得过0.05）。在比如，我们常用的VC片，由于氧化变为黄色，影响到疗效，将
12、它配制成0.05g/ml的水溶液，在440nm的波长处测定吸光度，不得过0.07。,比值 有时也会用峰谷吸收度的比值控制杂质限量。例如，碘磷定有很多杂质，如顺式异构体、中间体等，在碘磷定的最大吸收波长294nm处，这些杂质无吸收，但在262nm碘磷定的吸收谷处有吸收，则可利用碘磷定的峰谷吸光度的比值作为杂质限量检查指标，已知纯品碘磷定的A294/A2623.39，如果在262nm 处的吸光度增加，使峰谷吸光度之比小于3.39。因此，可以规定一个峰谷吸光度的最小允许值，作为限制杂质含量的限度。,三：比色法 测定能吸收可见光的有色溶液的方法称为可见分光光度法，通常称为光电比色法或比色法。,第四：含
13、量测定 根据Beer-lambere定律，物质在一定波长处的吸收度与浓度之间是线性关系。因此只要选择适宜的波长测定溶液的吸光度，就可以求出其浓度。通常应选择被测物质吸收光谱的吸收峰处，以提高灵敏度并减少测量误差，被测物质如有几个吸收峰，可选不易有其他物质干扰的较高吸收峰，一般不选光谱中末端吸收峰。,单组分物质的含量测定 就是物质有单一成份构成，常用的测定法有对照品对照法、吸光系数法、标准曲线法。标准曲线法不常用，个别药品项下有具体方法时用。下面具体讲以下前两种方法：,（1）对照品比较法 可根据供试品溶液及对照溶液的吸光度与对照品溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。C样品A样品C
14、对照/A对照 式中 A为吸光度值；C为测试液浓度（以mg/ml计）。 举例:双氯芬酸钠片 平均片重0.1044g 称样0.2096g 对照品称重0.0504g 稀释过程:样品加乙醇100ml,溶解过滤,再量取续滤液2ml加乙醇稀释至100ml. 样品吸收度值 284nm 0.419 对照品吸收度值 284nm 0.4410.4190.0504100.00100.002.0010000.1044 含量=-100%=95.40%0.441250.2096100.00100.002.00,（2）吸收系数法 中国药典规定的吸收系数。系指E1%1cm ，即在指定波长时，光路长度为1cm，试样浓度换算为1
15、（g/ml）时的吸光度值，故应先求出被测样品的E1%1cm值，再与规定的E1%1cm值比较，可计算出供试品的含量A E1%1cm（样品）-CL A为供试品溶液测得的吸光度值； C为供试品溶液的百分浓度，即100ml中所含溶质的克数（g/ml）： L为吸收池的光路长度（cm）。 E1%1cm样品 供试品的含量100E1%1cm标准 E1%1cm样品 为根据前式计算出的供试品吸收系数： E1%1cm标准 为药典或药品标准中规定的吸收系数。,举例:甲硝唑片 平均片重0.2609g 称样0.0658g 最大吸收277nm 稀释过程:样品加9-1000盐酸100ml,溶解过滤,再量取续滤液5ml加9-1
16、000盐酸稀释至200ml. 百分吸收系数 377 吸收度值 277nm 0.4610.4610.2609100.00200.00 含量=-100%=96.97%3770.06585.000.2100,二、多组分定量测定 解线性方程组法 等吸收双波长消去法 系数倍率法 导数光谱法,第四节 注意事项 （一）使用的吸收池必须洁净，并注意配对使用。量瓶、移液管均应校正、洗净后使用。,（二）吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是400nm2000nm。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm3000nm。吸收池的形状有长方形，方形和园筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml），光程要求极精确，透光的玻璃面要严格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭头“”，标明杯子使用时的透光方向，反方向使用会有偏差。石英杯通常还配有玻璃或塑料盖，用以防止样品挥发和氧化，以及杯内样品的快速混合。,
