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1、第8章 抗 体 制 药,第一节 概 述,第二节 单抗及其改造,第三节 抗体工程 第四节 抗体药物 第五节 疫苗,第一节 概 述1、 1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素血清，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。因为是被动免疫，虽然治疗效果很好，但不持久。2、 1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（ ）球蛋白、丙种（ ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。病人血清中具有抗体活性
2、及化学结构与抗体相似的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。 Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念，所有抗体是Ig，但并非所有Ig分子都有抗体活性。,3、1960年发现多发性骨髓瘤细胞有多种免疫球蛋白。由于病原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质，因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称为多克隆抗体。易出现非特异性交叉反应。4、1975年Khler and Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 McAb. 在临床上主要用于诊断和治疗。 McAb由一个B细胞克隆产生的，只能识别某一个抗原表位的高度特异性抗体。,McAb 在免疫导向疗法中存
3、在的困难（障碍）：A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有56h，难以维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。解决问题的方法或途径基因工程技术A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相对分子质量。,5、 1984年报道了人鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3。 6、1994年Winter创建了噬菌体抗体库 技术,以基因工程方法制备抗
4、体并发展成抗体工程。它是抗体研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体。,第二节 单克隆抗体及其改造（Monoclonal Antibody）,一、制备单克隆抗体的一般流程McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。,1、抗原与动物免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养基本方法：取适量
5、脾细胞（1108）与骨髓瘤细胞（21073107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释 。,用于细胞融合的骨髓瘤细胞的条件： 1、融和率高 2、自身不分泌抗体 3、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。,PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在4006000，浓度在10%60%范围内的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO（二甲基亚砜），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触
6、时间。（1）细胞融合液中的细胞类型：4或5种。（2）如何去除脾-瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性培养基,细胞融合后，可产生多种融合细胞，如脾脾、脾瘤、瘤瘤的融合细胞，而且还有许多未融合的骨髓瘤细胞。这些细胞比脾瘤融合的杂交瘤细胞增殖更快，并能将其淘汰。为此，可再将融合后的细胞立即移入选择性培养基中进行培养。常用的选择培养基为HAT培养基，它是用次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶配制的。其中氨基喋吟(A)能阻断DNA合成的主要途径，瘤瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾脾融合细胞和瘤细胞在这样的组织培养条件下，几天内亦迅速死亡。由于骨髓瘤细胞都是次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGP
7、RT)缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌吟(H)和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。,在最适的培养条件下大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活。在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞。所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。一般认为饲养细胞能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故
8、应用的较多。,3、筛选阳性克隆与克隆化常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培养液。软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。,筛选阳性克隆与克隆化因为抗体产生细胞只占所有脾细胞的5左右，所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。并检测大批标本。 免疫酶技
9、术因不需进行放射性核素操作，方法简便，又适于检测大批标本等优点而被广泛采用。通过引入生物素亲和素等放大系统可进一步提高灵敏性。一般说来免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。 免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组织标本为目的的抗体时，免疫荧光法则更有意义，在筛选抗体的同时，还能对所识别的抗原进行定位判定。下面以酶联免疫吸附试验筛选抗破伤风毒素抗体为例进行说明。,4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定染色体分析正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为6268，NS-1为5464，有中部和亚中部着丝点。杂交瘤
10、细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反。,5、单克隆抗体的大量制备（1）体外培养法：用于抗原免疫性极弱获得的抗体较少。多采用RPMI 1640培养液，添加10%-20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100 g/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛
11、血清。此法虽可减少污染，但产量不高。 悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达2107/ml, 收集的单克隆抗体可达400 g/ml。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达108/ml。,（2）动物体内诱生法：用于抗原免疫性较强。常用基本程序：接种前12周，小鼠腹腔注射0.5ml Pristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，712d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。,6、单克
12、隆抗体的纯化根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。体外诊断试剂IgG类-沉淀处理+亲和层析IgM类-沉淀处理+凝胶过滤体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析+阴离子交换层析，并注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。,动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序：（1）澄清和沉淀处理：a.1000g 离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质） b.20 000g 高速离心30min ,去除残留的小颗粒物质 c.用0.2 m微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体 d.饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱和硫酸铵能回收90%以上的抗体）。,（2）分离A、凝胶过滤：用于IgG和IgM类。常用S
13、ephadexG 200 作为分离介质，可收集到3个峰，最高峰为IgM，另外两个峰为 IgG。抗体回收率达5080%，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达95%以上。B、阴离子交换层析：用于IgG类的分离纯化。在pH7.4条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低离子强度下洗脱下来，其纯度很高。 IgG2b和IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。C、亲和层析：多用蛋白A亲和层析。适用于IgG类。IgG类与蛋白A的结合与pH 有密切的关系。鼠源性单抗在 pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合在蛋白 A柱上， IgG1稍
14、差，用 pH3.5缓冲液可洗脱下 IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱下 IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱下IgG2a， pH6.0可洗脱下IgG1。用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度和很高，但也有极微量的杂蛋白。,二、鼠源性单克隆抗体的改造 目的：一是降低免疫源性； 二是降低相对分子量，增加组织通透性。 原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），生物功能则决定于抗体分子的稳定区（C）。,鼠源性单克隆抗体的改造1、人鼠嵌合抗体（chimeric antibody） ：把鼠源性单克隆抗体的V区基因分离出来，分别与人Ig的C区基因连接，即成为人鼠嵌合抗体的基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达
15、出完整的Chimeric Antibody.2、改型抗体(Reshaping antibody)：用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人 Ig分子中的CDR序列，则可使人的 Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称CDR移植抗体 (CDR grafting antibody)。3、小分子抗体：小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/801/3。(1) Fab片段抗体：VH+CH1 (3)单链抗体：VH-Linker-VL(2) FV抗体：VH+VL (4)单域抗体：VH或VL（5）最小识别
16、单位（MRU）：单个CDR区构成,4、双功能抗体：双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)。是一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。5、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。是20世纪90年代发展的研究领域。类型如下：（1）配基配基型融合蛋白，如 CD4-Fc. （2）配基Ig型嵌合抗体，如 IL-2-Ig（3）配基FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3(4) 受体FV型融合蛋白（5）酶抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）,第三节 抗体工程,抗体研究的三个阶段： 以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体； 以1975年Khler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表； 以1994年Winter完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。在此基础上发展成抗体工程。他创建了噬菌体抗体库技术,克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。,
