基因工程制药讲义

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1、第二章 基因工程制药,2,第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 第七节 基因工程菌发酵 第八节 基因工程药物的分离纯化 第九节 基因工程药物的质量控制 第十节 基因工程药物制造实例,3,一、基因的概念: DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。,基因工程的基础知识,4,基因可自我复制 基因决定蛋白质结构 基因可突变 基因按功能分为结构基因；调控基因,二、基因的一般特性,5,1-DNA的结构 四种核苷酸（A T C G）连接。DNA二级结构为双螺旋结构。

2、 2-DNA的性质与功能 吸收光谱260 电场中泳动 变性 复性 杂交,三、DNA的结构与性能,6,（一）DNA的复制半保留复制,四、 DNA的复制与表达,7,（二）基因表达, 转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。转录后加工：剪切：除去内含子加帽：5加m7Gppp加尾：3加poly（A）,8,2、翻译：以mRNA为模板，tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程。（1）分为三个阶段：起始 延长终止,9, 基因工程: 通过对Nucleic acid 分子的Insert，Assemble and Recombinant而实现遗传物质的重新组合，再借助V

3、irus ，Bacterium ，Plasmid or other Vectors，将Target gene转移到新的 Host Cell System，并使Target Gene在新的Host cell system 进行Replication and Expression的技术。 基因工程主要研究任务: Gene isolation ，synthesis ， Incision(切割)，recombinant ，transformation and expression. Gene Manipulation/Gene cloning/DNA recombination. 基因工程技术最成功的

4、成就: 用于新型生物技术药物的研制,五、基因工程,10,基因工程基本过程,11, 传统制药存在的问题：A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求；C、由于免疫原性等缘故，使它们在使用上受到限制。 基因工程技术的特点： 能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。,第一节 概述,12,基因工程技术的应用特点：A、为癌种、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。B、基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基

5、因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。,13,利用基因工程技术生产药品的优点：,（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；,14,（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-

6、S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高； （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。,15,“863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是： 新型药物、疫苗和基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。,16,第二节 基因工程药物生产的基本过程,17,目的基因的克隆 构建DNA重组体 将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌 工程菌的发酵 外源基因表达产物的分离纯化 产品检验等。,基因工程药物制造的主要程序：,18,获得目的基因,组建重组质粒,培养工程菌,构建基因工程 菌或细胞,产物分

7、离纯化,除菌过滤,半成品检定,包装,成品检定,基因工程药物制备的一般过程,19,上游阶段： 主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。 目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。 选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。,基因工程药物生产的上游和下游,20,下游阶段： 从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。 此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计

8、和制造，电子计算机的优化控制等。,21,第三节 目的基因的获得,问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？ 对于真核细胞来源的目的基因，不能直接进行分离。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中的很小一部分，多拷贝基因也极少，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。 另外，原核表达系统有局限性，缺乏mRNA的转录后加工。,22,为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Kl

9、enow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。,一、反转录法,目的基因的获取途径：,23,1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,24,cDNA克隆示意图,mRNA,逆转录酶,ss-DNA,逆转录酶,ds-cDNA,ds-cDNA,25,1、mRNA的纯化,a. 细胞内RNA的组成和含量:DNA:95%核内，5细胞器RNA：75细胞质，10%核内，15%细胞器rRNA80-85%;tRNA10-1

10、5%;mRNA1-5%b. 真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。3-polyA（20-250AAA）-oligo(dT),26,在真核细胞中mRNA的3末端常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长达20250个腺苷酸，可采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。洗脱方法：是高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的mRNA。,27,纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图,28,2、cDNA第一链的合成,一般mRNA都带有3-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，在反转录酶的催化下，合成cD

11、NA链。,29,3、cDNA第二链的合成,先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。 由于第一链cDNA链3末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。 此反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。,30,4、cDNA克隆,用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌体DNA（如gt10、 gt11等）。 根据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型和非表达型载体。,31,pU

12、C及gt11为表达型载体，在cDNA插入位置的上游具有启动基因顺序；而pBR322及gt10为非表达型载体。在cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载体。 cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。 选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。,32,cDNA片段与载体的连接,方法一：加同聚尾连接用3末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA的3末端带上互补的同型多聚体序列，如载体加上polyC（或A）的尾巴，则cDNA加上polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与cDNA连接而不能自我环化，借助同型多聚体的退火

13、作用形成重组分子，最后用T4DNA连接酶封口。,33,34,方法二：加人工接头连接 用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。 所谓人工接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接； cDNA中也可能也带有同样的限制酶切点，为了保护cDNA不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制酶切位点。,35,36,5、将重组体导入宿主细胞,体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑；或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。,37,6、cDNA文库的鉴定,根据重组体的表型

14、进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。,38,genomic library,39,cDNA library,40,7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆，主要采用： （1）核酸探针杂交法用层析和高分辨电泳等技术纯化微克量的目的蛋白质，根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。,41,（2）免疫反应鉴定法在既无可供选择的基因表型特征，又无合适探针的情况下，本法是重要途径。用表达型载体构建的cDNA文

15、库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。,42,二、化学合成法,较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。 方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。,43,人工化学合成基因的限制：a. 不能合成太长的基因。最长50-60bp，只适用于克隆小分子肽

16、的基因。b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。c. 费用太高。,44,克隆蛋白质药物基因的一个主要目的是为了高效的表达该基因，从而大量地市场原本难以获得的药物。基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。,第四节 基因表达,45,一、宿主细胞的选择宿主细胞的基本要求： 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA技术操作； 产物的产量、产率高，且易提取纯化。,