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1、,课后复习,抗生素类分类：四环素类、氯霉素类、磺胺类药物、硝基呋喃类 CAPs是禁止用于食品动物并不得在动物性食品中检出的抗生素。 盐酸克伦特罗毒性,第九章 食品中真菌毒素检验,9.1 概述 9.2 黄曲霉毒素的检验 9.3 赭曲霉毒素A的检验 9.4 展青霉素的检验 9.5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验 9.6 T-2毒素的检验 9.7 玉米赤霉烯酮的检验,第一节 概述,1.1 霉菌及霉菌毒素 1.2 霉菌毒素的命名及分类 1.3 霉菌毒素的产生条件 1.4 毒性与危害,1.1 霉菌及霉菌毒素,霉菌（fungi）：是菌丝体比较发达而又没有较大子实体的一部分真菌的通称。霉菌毒素（M
2、ycotoxin）：指少数霉菌在污染食品上繁殖所产生的有毒代谢产物，它对人、牲畜引起损害。,霉菌产毒的特点,1）霉菌中仅少数菌种能够产毒，少数 产毒 霉菌只有一部分菌株可以产毒。 2）霉菌产毒具有可变性 3) 产毒的菌种所产生的霉菌毒素无严 格专一性 4） 产毒霉菌产生毒素需一定条件。,常见霉菌和霉菌毒素名称,曲霉菌属：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素 青霉菌属：黄绿青霉素、展青霉素、黄天精、桔青霉毒素 镰刀菌属： 单端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮、丁烯酸内酯、串珠镰刀菌毒素,1.2 霉菌毒素的命名及分类,霉菌毒素的命名常按产生毒素的霉菌名称来确定 霉菌毒素的分类尚无统一的系统命名方法，常
3、用的分类法是按毒素作用部位分为肝脏毒素、肾脏毒素、神经毒素等；按毒素来源分为霉菌毒素类、青霉毒素类、镰刀菌毒素类；按作用机理分为抑制蛋白质合成类、作用于离子通道类、作用于细胞骨架类、作用于细胞突触类；按毒素化学结构分为二呋喃类、内酯环类、醌类。,1.3 霉菌毒素的产生条件,霉菌毒素产生过程：是霉菌的次级代谢产物。在生长后期，初级代谢产物：如三羧酸循环的中间产物乙酰辅酶A、丙酮酸等大量堆积，使其启动另外合成途径。产生条件：水分、pH值、环境温度、湿度及氧气等因素。粮食水分在1718、湿度在8090、温度在2530及有氧条件、中性附件处有利于霉菌的繁殖。,1.3 霉菌毒素的产生条件,食品菌相：共存
4、于食品中的细菌种类和相对数量的构成。如：粮谷中以曲霉和青霉常见，小麦和玉米以镰刀菌污染为主。因此，通过对食品霉菌菌相的分析，大致可判断可能产生的毒素种类。黄曲霉毒素： 玉米、花生等青霉菌毒素： 大米、水果等镰刀菌及毒素：小米、玉米等,霉菌污染食品质量的评定及食品卫生意义,1) 霉菌菌相构成 田野霉：新鲜，交链孢酶素 曲霉、青霉:可检毒素，但不表示变质 毛霉、根霉：粮食霉变2) 霉菌的污染度：即单位重量或容积的食品或100粒粮食上霉菌总数，表示食品带染霉菌情况 。,1.4 毒性与危害,霉菌引起食品和饲料霉变造成的经济损失很大，据介绍，世界上平均每年由于霉变而不能食用的各类谷物约占总量的2。60年
5、代以来，不断发现霉菌污染食品引起中毒的事件，研究其原因是由于不少霉菌的代谢产物为有毒物质。1960年英国的10万只火鸡发生肝损害而死亡，后来证实是饲料中黄曲霉菌的代谢产物黄曲霉毒素所致。 可引起急性中毒，更多是慢性中毒。致癌、致畸和致突变的物质。特别是黄曲霉毒素。,第二节 黄曲霉毒素的检验,2.1 概述 2.2 薄层色谱法 2.3 酶联免疫吸附测定法 2.4 高效液相色谱测定法 2.5 微柱筛选法,2.1 概述,理化性质：结构，黄曲霉毒素（aflatoxins,AFT）是含有二呋喃环和香豆素（氧杂萘邻酮）一类化合物的总称；溶解性，难溶于水、乙醚、石油醚、己烷等，易溶于甲醇、三氯甲烷、苯、乙腈等
6、极性较小的有机溶剂；稳定性，对光稳定，一般烹调加工温度不被破坏，中性和弱酸性条件下稳定，碱性条件下易分解为无毒物质；对氧化剂不稳定。,天然食品中常检出AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、AFTM1。 从结构上看，可把它们分成两大类：即B族和G族，从B族和G族又派生出许多衍生物。所谓B族和G族的来源是在研究AFT初期，用氧化铝板作薄层板，在紫外光照射下，可观察到一些物质发蓝色荧光(blue)，称为B族；另一些物质发绿色荧光(green) 称为G族。,主要来源：主要是黄曲霉（Aspergillus flavus部分产毒） 、寄生曲霉(Aspergillus parasitlas 所有菌
7、株产毒)等代谢产物。AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉子等。此外，在核桃、乳及乳制品、干辣椒中也有发现AFT的污染。 常检出AFTB1，奶和奶制品中易检出AFTM1。 在我国，产生黄曲霉毒素的菌种主要是黄曲霉，一般湿热地区产毒株多、产毒量大。,黄曲霉菌丝状菌落,毒性与危害：是一类毒性很大的物质，对动物能造成急性中毒，其毒性是氰化钾10倍；还能引起慢性中毒和致癌、致畸、致突变。其慢性中毒的主要表现是动物生长发生障碍，肝脏出现亚急性或慢性损伤AFT是目前发现的最强的化学致癌物质。比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，所以，世界卫生组织(WHO)在确定重点研究的毒物中，AFT
8、被列在首位。其作用部位主要是肝脏。 AFTB1在动物体内经羟化反应生成两种主要代谢产物AFTM1和AFTQ。前者与AFTB1的毒性和致癌性近似。牛饲料、牛奶。,AFB1与其它毒物的LD50,慢性毒性,A 肝组织学变化：肝细胞变性，坏死，再生结节，肝管上皮增生及肝纤维化、肝硬化B 肝功能变化：血清转氨酶，ATP ，碱性磷酸酶,球蛋白升高C 其它症状：生长发育迟缓，体重下降，食物利用率降低，母畜不育或产仔少等。,AFB1 对大鼠致癌性,AFT 对人类毒性,A人体细胞体外试验：抑制细胞分裂、DNA合 成、染色体破碎 B人类急性中毒：非洲、印度、中国等均有摄入AFT污染食品中毒报道2005年5月肯尼亚
9、7人食用AFT污染玉米中毒死亡 C人类肝癌流行病学：AFT污染程度与人群肝癌发病率死亡率正相关；AFT增加乙肝患者肝癌发病率,黄曲霉毒素摄入量与原发性肝癌发病率,卫生标准：污染食品的主要是AFTB1、B2、Gl 、 G2、 M1等，其中尤以AFTB1最为重要。世界卫生组织的粮农组织(FA0WHO)规定食品中AFTB1不得超15ppb；美国不得超过25ppb；日本规定不得超过10ppb；以色列和瑞典规定不得检出。我国对各种主要食品中AFT B1允许含量是：玉米、花生仁、花生油及其制品不得超过20ppb；大米和其他食用油不得超过10ppb；其他粮食、豆类、发酵食品不得超过5ppb；婴儿代乳品不得检
10、出。,预防措施,去毒： 挑选霉粒 物理方法: 碾轧加工法加水搓洗吸附法 化学方法：加碱处理法 二甲基乙醚去油脂中的AFB1 新方法：高压破坏、臭氧、微生物去毒,二、霉菌毒素的检测黄曲霉毒素的检测我国涉及黄曲霉毒素的限量及检测的国家标准有 GB 27611981(食品中黄曲霉毒素B1允许量标准)、 GB 9676-1988(牛乳及其制品中黄曲霉毒索M，限量卫生标准)、 GBT 17480-1998(酶联免疫吸附法测定饲料中黄曲霉毒素B1)、 GBT 500922-1996薄层色谱法(第一法)ELISA(第二法)测定食品中黄曲霉毒素B， GBT 5009231996薄层色谱法(第一法)微柱筛选法(
11、第二法)测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,2.2 薄层色谱法,原理：样品中AFTB1经甲醇-水溶液提取后，浓缩、苯-乙腈溶液定容、点样于硅胶G薄层板上，经展开分离后，在波长365nm紫外光下观察蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度于标准比较来确定含量。 样品处理：样品经正己烷或石油醚和甲醇-水溶液（5545）振荡提取，样品中油脂、色素等杂质进入正己烷层，而AFTB1和水溶性杂质留在甲醇-水层。用三氯甲烷反提取甲醇-水层，由于AFTB1更易溶于三氯甲烷层，从而进入三氯甲烷层，杂质留在水层。将三氯甲烷层通过盛有无水硫酸钠的慢速定量滤纸过滤于蒸发皿中，水浴通风挥干，冷却后用苯-乙腈（
12、982）混合液溶解残渣，作点样液。,定性测定：将样液与标准液点样，用丙酮-三氯甲烷（892）展开，晾干在365nm紫外光下观察，若在Rf值0.6附近有蓝紫色荧光点，可能有。然后在点样处滴加三氟乙酸，则AFTB1水解成AFTB2a ，极性增大， Rf值由0.6降为0.1。 定量测定：以最低检出限量0.0004g为标准。 双向展开法：先用无水乙醚作横向展开，将干扰的杂质展至样液点外而AFTB1不动，然后再纵向展开。,2.3 酶联免疫吸附测定法,原理：将已知抗原吸附在酶标微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品提取液的混合液，竞争孵育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物，消除多余抗体成分
13、及游离的抗原抗体复合物，然后加入酶标记的第二抗体，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生反应，生成有色物质，根据标准和样品的吸光度值，计算样品中的抗原含量。 样品处理：粉碎均匀样品用乙腈-水（5050）（碳酸盐缓冲液pH至8.0）进行提取，滤纸过滤，滤液用含0.1牛血清白蛋白（BSA）的洗液稀释后，供检测。,测定：用包被抗原（ AFTB1和牛血清白蛋白结合物）包被酶标微孔板，4过夜。用洗液洗去酶标微孔板多余抗原后，加入毒素标准溶液或样品提取液，然后再加入AFTB1抗单克隆抗体，37孵育。多余抗体用洗液洗去，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG， 37孵
14、育。再次洗涤酶标微孔板，加底物四甲基联苯胺溶液， 37 孵育后用硫酸中止反应。 方法说明：最低检出限浓度为0.01ppb；ELISA试剂盒低温保存。,包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体,加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体,加底物 显色,根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定,饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 赭曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌 ）,甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析,ELISA在饲料安全检测
15、中的应用,ELISA用于农药残留的检测,河豚毒素,植物毒素如罌粟碱、吗啡、藻类毒素,苯并芘,主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（ FN ）、甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、草不绿（ Alachor ）、西维因（ Carbaryl ）、多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。,农药的检测：,2.4 高效液相色谱测定法,原理：样品中的黄曲霉毒素经C18柱分离，用带荧光检测器的HPLC检测，时间定性面积定量。 样品处理：（1）样品提取，适量样品加水浸润后加入三氯甲烷振摇提取，加无水硫酸钠滤纸过滤于量筒中。（2）样品净化和衍生化反应，将少量提取液通过多功能净化柱层析管，用三氯甲烷-正己烷、三氯甲烷-
16、甲醇淋洗液洗除杂质，用丙酮-水洗脱，水浴挥干用三氯甲烷溶解残渣，取部分溶液加入正己烷、三氟乙酸（TFA）混匀静置30min，使AFTB1衍生为AFTB2a。氮气吹干，加入少量流动相溶解供HPLC测定。,方法说明： 提取时也可使用水溶性有机溶剂，如乙腈-水（91）或甲醇-水（82）。 本法流动相含有磷酸盐，用完后应用去离子水彻底冲洗，再用甲醇冲洗，以保护色谱柱。流动相也可用不含盐的组分如乙腈-甲醇-水（50150300）。 衍生化的目的是确证样品中是否含有AFTB1,二、免疫亲和层析-高效液相色谱法 原理：试样用甲醇-水提取后，用免疫亲和层析柱净化，以水或含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗柱除去杂质，再用甲醇洗脱交联在柱上的黄曲霉毒素，洗脱液经高效液相色谱分离，柱后衍生后，荧光检测器检测，标准曲线法定量,2.5 微柱筛选法,原理：样品经提取后通过装有氧化铝、硅镁吸附剂的微柱管，AFT被吸附后在365nm下显示蓝紫色光环，其荧光强度与AFT在一定浓度范围成正比。 样品处理：磨细混匀样品用甲醇水振荡提取过滤，再加三氯甲烷反萃取，无水硫酸钠脱水即样品提取液。 测定方法：三支管中分别加入样品、标准品和三氯甲烷。加展开剂（19）后照射。若出现微黄色荧光环，则未检出AFT，若出现蓝紫色荧光则进一步分析。 方法说明：所测结果为AFT总含量；吸附剂应活化；柱管要保持垂直；洗脱废液要密闭。,
