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1、线粒体疾病的分子生物学检验 Molecular diagnosis for mitochondrial related disorders,线粒体（Mitochondrion）,2,1. 真核细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命10天 2. 多数细胞含几个到几千个线粒体 3. 每个线粒体含2-10 线粒体DNA（mtDNA）,3,线粒体功能,Mitochondrial Disease.Chest 2001; 120:634648,ATP,能量代谢,其他功能,储存钙离子调节膜电位并控制细胞程序性死亡细胞增殖与细胞代谢的调控合成胆固醇及某些血红素产热,Wikipedia,线粒体病 Mi
2、tochondrial disorders,发现- 1962 年， Lufe 等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢率，同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年， Wallace 等报道了首例由线粒体 DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA 突变可引起人类疾病。定义- 是遗传缺陷引起线粒体异常，致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。发病率- 约为1:5000（约每5000人中1人发病）,Smeitink 2006,线粒体病 mitochondrial disorders, 是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病,线粒体蛋白
3、,16,569 bp circular double stranded (mtDNA) 20%,1,500 nuclear genes 80%,structural protein of the OXPHOS complexesprotein required for assembly of OXPHOS complexesproteins involved in mtDNA translationproteins involved in mtDNA maintenanceproteins involved in mitochondrial fusion and fission,Douglas
4、 C. Wallace, 18171819,Shoubridge, 2001; Schapira，2000,进一步导致线粒体功能异常：,底物的运输缺陷； 底物的利用缺陷； 柠檬酸循环异常； 氧化磷酸化脱偶联； 呼吸链异常。,发病特点,核基因突变常染色体隐性、显性遗传或X-连锁遗传,线粒体基因突变母系遗传（突变的mtDNA在母血增加，受累及的后代发病频率增加）,mtDNA突变与临床表型之间关系复杂，主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。,遗传异质性,婴幼儿起病较常见,编码线粒体结构蛋白的核基因突变 进行性外眼肌麻痹（PEO
5、）、线粒体神经肠胃脑肌病、Leigh氏综合征线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变 2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位16(MRPS16)纯合突变，导致先天畸形伴张力衰竭、四肢水肿、肝转氨酶活性升高并乳酸亚基中毒症， 该女婴在出生后3天死亡。,核基因突变,线粒体基因突变,突变的影响： 引起呼吸链功能缺陷氧化磷酸化酶异常阈值效应：组织特异性突变的 mtDNA 在复制分离时可能不均等分配母系遗传：不同突变后代发病风险不同。相比A8344G突变，携带 A3243G 突变的母系后代更容易发病。突变分布：同质性各器官组织分布相同异质性不同组织、细胞分布不同,一般特点,母系遗传
6、（Maternal Inheritance）,11,同质性突变与异质性突变,12,线粒体基因 同质性（Homoplasmy） 0 或 100% 异质性（Heteroplasmy）0-100%,核基因 纯合子（Homozygous） 0 或 100% 杂合子（Heterozygous） 50%,mtDNA同质性/异质性突变与阈值,13,线粒体基因突变,点突变目前已报道的mtDNA 点突变将近330种，涉及mtDNA编码的各个基因，其中结构基因突变177种、tRNA基因突变137种、rRNA基因突变12种、D-Loop区突变2种LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、肌阵挛癫痫、破碎红
7、纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等 重排重排突变逾数百 遗传性痉挛性截瘫等 (http：/www.mitomap.org),线粒体疾病是复杂性疾病,遗传方式复杂 常染色体隐性遗传（Autosomal Recessive） 常染色体显性遗传（Autosomal Dominant） 性连锁遗传（Sex linked） 母系遗传（Maternally inherited） 临床表型复杂 累及多系统（Multisystemic involvement） 影响几乎所有组织器官（Any organ or tissue can be affected）,15,线粒体功能涉及众多的组织器官,16,线粒体病的
8、共同临床特点,婴儿期发病：常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。儿童发病：见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。中枢神经系统损害：共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等周围神经损害：交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征视听神经损害：视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型听力丧失出现在KSS肌肉病见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO,（高度临床变异性）,Chinnery et al. Lancet 2000,线粒体疾病的生化诊断,当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。,代谢
9、产物分析（血液、尿液、脑脊液等） 血液可以正常，但脑脊液多异常，（动脉比静脉好）；乳酸/丙酮酸比高(50:1)提示呼吸链受到阻断。正常不除外线粒体疾病。,酶测定氧化磷酸化（OXPHOS）系统的酶活性测定。（western、比色法等）方法不稳定一般情况下，血清CK（肌酸激酶）正常或轻度升高；升高占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹；mtDNA丢失时非常高。,J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292,19,线粒体疾病的生化诊断,当患者基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。,肌肉活检 线粒体病的肌肉病理改变特点： （1）出现线粒体结构异常、细胞
10、色素阴性肌纤维或破碎红纤维（ RRF ）为主要病理改变。 （2）上述病理改变出现的频率高。 （3）缺乏其他的肌肉病理改变。,J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292,儿童及成人线粒体疾病的诊断标准,A 符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现 如KSS、CPEO、MELAS、MERRF 等； 多系统不明原因发病必须至少三个系统出现临床症状除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能排除其它代谢和非代谢疾病 B 肌活检 在骨骼肌中存在2%破碎样红肌纤维,主要诊断标准,(Bernier et al, 2002)(3, 5),21,C 有以下一种或多种呼吸链
11、酶活性受抑制的表现：50岁以下肌活检COX阴性肌纤维2%；50岁以上肌活检COX阴性肌纤维5%；任一组织中呼吸链酶活性20%；任一细胞系中呼吸链酶活性30%；多于两组织内相同呼吸链酶活性30%；,主要诊断标准,次要诊断标准：,A 症状符合线粒体脑肌病的临床表现； 至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现： 3050岁肌活检RRF在1%2%； 30 岁以下肌活检出现RRF； 电镜下见广泛线粒体异常；B 至少一种呼吸链功能受抑制的表现： 生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%30%； 用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少；,(Bernier et al, 2002)(3, 5),次要诊断标准：,C
12、发现可能相关的mtDNA 异常；D 一种或多种氧化磷酸化受损的表现： 脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高； 若疑为KSS，脑脊液蛋白质增高； PET或31P-MRS证实肌肉或脑代谢降低； 最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。,(Bernier et al, 2002)(3, 5),符合以上2个主要诊断指标或1个主要诊断指标及2个次要诊断指标的即为确诊线粒体病；符合1个主要诊断指标及1个次要诊断指标或至少3个次要诊断指标的为拟诊线粒体病；符合1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。,J inherit Metab Dis.2011 April;3
13、4(2):283-292,线粒体病诊断时应注意,基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活性等相结合要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系散发与遗传的相关性 ，诊断是否遗传需排除环境、药物和衰老等因素,第一节 线粒体基因组与疾病,线粒体基因组及其表达系统 http:/www.mitomap.org 线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系 线粒体基因组变异与疾病,26,27,人类线粒体基因组,Light strand: 8 tRNA and 1 mRNA (ND6) Heavy strand: 14 tRNA, 2 rRNA, a
14、nd 12 mRNA Polycistronic with posttranscriptional processing,基因组小, 仅16569 bp双链环状DNA13 结构基因 / mRNA22 tRNA 基因2 rRNA 基因12S rRNA 基因16S rRNA 基因非编码区D-loop（约1120bp）L链复制起始区（约3050bp，tRNAAsn-tRNACys）高突变率,线粒体基因组及其表达系统,The two strands of mtDNA are differentiated by their nucleotide content with the guanine rich
15、 strand referred to as the heavy strand, and the cytosine rich strand referred to as the light strand. The heavy strand encodes 28 genes, and the light strand encodes 9 genes for a total of 37 genes. Of the 37 genes, 13 are for proteins (polypeptides), 22 are for transfer RNA (tRNA) and two are for
16、the small and large subunits of ribosomal RNA (rRNA).,Transport chain (13 peptides) Many of the genes encode the transport chain:,2 rRNAs Mitochondrial rRNA is encoded by MT-RNR1 (12S rRNA) MT-RNR2 (16S rRNA).,22 tRNAs The following genes encode tRNA:,Control region D-loop,576,Replication,Human mito
17、chondrial DNA (mtDNA) has three promoters, H1, H2, and L (heavy strand 1, heavy strand 2, and light strand promoters). The H1 promoter transcribes the entire heavy strand and The L promoter transcribes the entire light strand. The H2 promoter causes the transcription of the two mitochondrial rRNA molecules.,
