第五章.花药及花粉培养 一. 花药培养 二. 花粉及小孢子培养,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一、花药培养,,,1．概念 花药培养(anther culture):把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程.,,,Tobacco anther with developing haploid plantlet, arising from the microspore,,,2、花药培养的基本程序是： 外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养-移栽,,,（1）外植体的选择 基因型的选择 通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物 同一植物的不同类型、不同品种对花药培养的反应也是不同的 因此在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做供试材料的生理状态 在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低花粉的发育时期 四分体 — 小孢子 — 单核花粉 — 双核花粉 最适期 涉及到具体的植物，花药培养的取材时期并不绝对相同，如番茄以减数分裂期的幼嫩花药为好，而云苔属植物的某些材料则以花粉成熟时的花药为好。
在花药培养中，如果每次取材时都要进行花药发育时期观察是很不方便的，一般是在试验之前，对花药的发育时期和其相对直观的生长发育特点进行相关研究，通过直观的对应性状来确定花粉的发育时期，如花粉发育时期与花药大小、花蕾大小、花冠展开程度、旗叶与倒二叶之间的距离等的关系，然后根据这些直观特征判断花粉发育时期，取材例如： 柑橘在花冠露白时大多数花药处于单核晚期 马铃薯在花冠漏出萼片一半时大多数处于单核晚期 烟草则在花冠漏出1/3-1/2，花冠和花萼等长时为花药培养的最佳时间 小麦：幼穗中部在倒二叶的叶耳的上下1厘米之间a、醋酸洋红法 将花药放在载玻片上，加一滴1%的醋酸洋红（于100ml煮沸的45%醋酸中缓慢加入1g洋红，回流煮沸8h于50℃下过滤即得），用镊子把花药捣碎，加盖玻片后在显微镜下检查茄科、禾本科的大多数植物的花药均可用此法，但水稻、番茄、芸苔属和许多木本植物的花药细胞核不易着色，可采用桔花青-铬矾法,,,b、桔花青-铬矾法 将花药先在卡诺固定液固定20min，然后取出放载玻片上，加桔花青-铬矾染色液制片和镜检细胞核染成黑色 桔花青-铬矾染色液的配方： 将5g铬明矾（K2SO4. Cr2（SO4）3.24H2O）加入100ml蒸馏水中后加1g桔花青混匀，加温至沸腾，并煮沸5min，冷却至室温过滤，并加蒸馏水至100ml。
2)花药预处理 为了提高花药培养的成功率，需要在接种前对实验材料进行各种预处理，已经证明有效的预处理方法有： A低温预处理 低温预处理可以明显提高花粉胚的诱导效率但各种植物要求的温度和处理时间有差异： 烟草 7～9℃ 7-14天 水稻 10℃ 10～14天 柑橘 3℃ 5～10天 马铃薯4℃ 2天,低温预处理的作用机理， 学者们提出以下几点：,,1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体 2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率 3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系 4) 无论哪种机理正确，但结果是预处理能促进花粉启动，提高诱导率和再生率B热处理 在一些物种中（芸苔属），将花芽或完整植株在30℃下处理24h或40℃下处理1h，能够刺激花粉的胚胎发生或者接种以后将其放在高温下处理3-8天，可以显著提高花粉植株诱导率。
已在小麦，甜椒中得到应用C、离心预处理 Tanaka将单核后期的烟草花药在10000-11000r/min的速度下离心30min，产生小植株的频率从30.5%提高到38.2% D、乙烯利预处理 培养基中较低浓度的乙烯利（40mg/L）对花粉愈伤组织的形成有明显的促进作用可能原因促使花粉的分裂E甘露醇预处理 将花药在0.3mol/L甘露醇溶液预培养3-5d，可以提高花粉胚的诱导率重蒸水表现出与甘露醇相似的结果这可能是由于这种处理方式使小孢子处于碳饥饿状态，导致花粉从正常发育途径转向雄核发育途径3)外植体的消毒 挑出适宜培养的花蕾或幼穗，一般先将花蕾或幼穗的表面用70%乙醇浸泡1min，然后在0.1%升汞中浸泡3-5min，用无菌水冲洗3-5次 如果花蕾包裹严密，内部一般是无菌的，比如小麦，只需用沾有70%酒精的纱布对叶鞘进行表面擦拭就可达到灭菌的目的4）接种 将消毒过的材料置于超净工作台上，无菌剥取花药进行接种，在剥取花药时，应注意在整个操作过程中尽可能避免花药受到损伤，否则常常会刺激花药壁形成愈伤组织，如果是花药较大的材料，可用镊子剥开花蕾，夹住花丝，取出花药。
如果花器很小，则可以借助解剖镜夹取花药，或只把花被去掉，将其余部分接种在培养基上，接种时尽量减少花药在空气中的暴露时间5）培养基及培养条件,培养基 花药培养常用的基本培养基：H 、C17、MS（Murashigc & Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976) 附加成分：蔗糖, 植物生长调节物质培养条件－温度和光照 温度：不同植物对温度的要求不同，如:柑橘在20℃以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到21～25℃时便会有胚状体形成，而当温度提高到26℃以上时又完全不能形成胚状体 油菜若将接种后的花药在30℃条件下培养2～3天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦在33℃条件下培养3～5天，可提高成愈率和绿苗率 光照：先弱后强,,（6）移栽 移栽看来容易，其实不然例如小麦等越冬作物，花粉植株生长至适合于移栽的大小时，适值盛夏，自然气温很高，按期移栽很难成活，应当在4℃冰箱中冷藏越夏9月底将试管苗取出在自然光下炼苗5-7d，然后洗净琼脂，进行移栽，移栽后在苗床上搭盖塑料薄膜棚。
移栽前如果根系不发达，可以将试管苗的老根剪除干净，移入生根培养基中诱导生根7）花粉植株的倍性及染色体加倍技术 花粉植株的倍性鉴定，最可靠的方法是对茎尖或根尖细胞进行染色体记数 染色体人工加倍最有效的方法是用一定浓度的秋水仙碱处理单倍体植株的生长点或分蘖节 对于烟草等双子叶植物来说，将具有3-4片真叶的试管苗置于灭过菌的0.4%秋水仙碱溶液中浸泡24-48h，用无菌水洗净后在接种于新鲜培养基中，可使25%左右的单倍体幼苗加倍成为二倍体,,,禾本科植物在分蘖期，将花粉植物从土壤中挖出，洗净根部泥土，浸泡在含有1%-2%二甲基亚砜秋水仙碱溶液中，注意一定要将分蘖节没入药液中不同植物处理浓度和时间不同，小麦：0.04% 8h ，水稻：0.2% 24h，处理期间的温度最好保持在8-15℃，处理后用流水冲洗数小时，重新移栽3影响花药培养的因素 ①基因型 ②发育时期 ③植株的生理状态 ④预处理 ⑤培养基和培养条件 ⑥花药的接种密度（密度效应） ⑦培养的方法与方式：固体培养、液体培养（Ficoll）、双层培养、分步培养、条件培养,,,固体培养,Anther and haploid plantlets on a solid medium containing activated charcoal,,A、液体培养法 液体培养液层0.5mm左右，可以加入一些Ficoll作为漂浮剂，使花药全部不下沉而漂浮在液面上，这样通气良好，提高了培养效果，要注意及时转移沉于瓶底部的长大的愈伤组织，否则会影响再分化培养的效果 液体培养具有一定的优越性： 在液体培养中不存在位置效应；可以在培养过程中补加新鲜培养基和重新调整培养基的成分；液体培养有利于花粉粒的释放及分裂形成愈伤组织 但如何掌握转分化的时期等细微环节直接影响到花药培养的效果,,,,Anther and haploid plantlets on a liquid medium containing activated charcoal,B、双层培养,,在35mm*10mm的小培养皿中铺加一层（1ml）琼脂培养基，固化后，在其表面再加入0.5ml的液体培养基。
优点在于： 花药在培养的早期可以从活性高的液体培养基中汲取营养，花粉胚长大后又不会沉没，可以在通气良好的条件下分化成植株Anther and haploid plantlets on a double layer medium. The solid lower part contains charcoal while the upper liquid layer contains the growth regulators,C、条件培养基培养,,用预先培养过花药的液体培养基再次进行花药培养，可使花药培养效率大大提高条件培养基不存在种的特异性，例如培养过小麦花药的培养基对大麦同样有效4.影响雄核发育的因子,营养需要：正常情况下，在一个小孢子中只发生2次有丝分裂，但雄核发育涉及到反复的多次分裂药壁因子：大量的证据表明,在花粉胚发育过程中花药壁起着重要的作用Pelletier和Ilami(1972)通过一系列的移植实验证明，即使把一个品种烟草的花粉移植到另一个品种的花药中，前者也能顺利地发育成胚诱导雄核发育的花粉发育时期：与r-RNA合成有关的基因，在花粉第一次有丝分裂之后似乎会“关闭”大约24小时。
因此只有刚刚通过第一次有丝分裂的小孢子，才能被诱导进行孢子体方式的发育,5、花药培养中单倍体形成的途径,根据小孢子最初几次分裂的方式，可将离体条件下雄核发育的途径分为四种第一种途径：单核小孢子进行一次均等分裂，形成两个等同的子细胞，而不是形成 相互有别的营养细胞和生殖细胞两个等同的子细胞都参与孢子体的发育 第二种途径：单核小孢子先进行一次正常的非均等分裂，然后通过营养细胞的进一步分裂形成孢子体生殖细胞或者完全不再分裂，或者分裂1~2次后即行退化这种发育途径在烟草、大麦、光叶曼陀罗、辣椒中都普遍存在第三种途径： 在天仙子中，花粉胚主要是由生殖细胞单独形成的，营养细胞或是完全不再分裂，或只分裂有限几次即停止无论在哪种情况下，营养细胞最终都变成一个类似胚柄的结构，附着在由生殖细胞起源的胚的胚根一端 第四种途径：如在第2种途径中一样，形成一个营养细胞和生殖细胞但在这种情况下，两个细胞都进一步参与孢子体的形成这种雄核发育途径迄今还只见于南洋金花A、通过胚状体形成单倍体植株 B、通过愈伤组织形成植株 高浓度生长素产生愈伤组织，低浓度利于胚状体的诱导 通过愈伤易产生混倍体,,,,,马铃薯花药培养中胚状体和愈伤组织的倍性,6、花药培养的意义,,a、缩短育种年限 常规育种，杂种F2代开始分离，继续自交，通过不断选择和淘汰，一般需到F5—F6代能得到纯合后代。
用花药、花粉（n）培养，得到单倍体植株，染色体加倍后，获得纯合二倍体（2n）这样，从杂交到获得纯合株系，只需二个世代因此，可缩短育种年限3—4个世代b、提高选择效率 F1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，进而发育成花粉用花粉培养获得单倍体再生植株（n），配子基因型在再生植物体中完全表达，即再生植物基因型是多种多样的，为育种选择提供了广泛的变异类型并且隐性基因可以得到充分表达单倍体植物经染色体加倍可获得二倍体植物 因此，花药、花粉培养与常规育种相结合，可以大大提高育种选择效率。