《基因工程菌发酵》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程菌发酵（62页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第八章 发酵工程在现代生物技术中的应用,第一节 基因工程菌发酵,第一节 基因工程菌发酵,一、基因工程基本知识 基因工程(genetic engineering)的定义基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体(供体)的基因或基因组提取出来或者人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体(受体)的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。又称重组DNA技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,工程菌的应用,1、基因药物 例如，红细胞生成素、胰岛素、干扰素、乙肝疫苗、生长激素和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等。 2
2、、其它发酵产品 例如酶制剂、氨基酸（苏氨酸、色氨酸）、抗生素等。,基因工程的基本步骤,（一）载体,载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制。,1、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 2、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 3、有适合的标记（抗药性基因），易于选择。,作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：,其他条件： 分子较小，可携带比较大的片段。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并
3、且尽可能是高效的表达。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。,载体的种类和特征,（二）载体DNA与外源基因片段的连接,1、黏性末端DNA分子之间的连接,2、平末端DNA片断的连接 （1） T4DNA连接酶 （2） 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法,同聚物加尾法,用5 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断,在A和B分别中加入dATP和dTTP,同聚物尾巴1040个碱基,末端转移酶,同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，获得插入片断进
4、行进一步的研究。,衔接物连接法 衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约1020个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。,衔接物连接法,双衔接物连接法的基本程序,cDNA链的合成,通过DNA聚合酶合成第二链,加入Sal I衔接物,S I核酸酶作用后的末端单链突出序列， 由Klenow补齐，加入第二衔接物Ecol I,优点：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。,在用D
5、NA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。,DNA接头（adapter）连接法： 1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞 博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5-P，暴露出5-OH，不能产生稳定的二聚体分子。,DNA接头连接法,（三）目的基因导入受体细胞,（四）转化细胞的筛选及表达产物的鉴定,1、重组体的筛选 2、
6、表达产物的鉴定, 互补的检测,二、基因工程菌的发酵,就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。,（一）质粒的稳定性,1、质粒不稳定的类型 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化,2、质粒不稳定产生的原因 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 这两种菌比数率差异的大小。,对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数： 低拷贝质粒工程菌
7、产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。,3、质粒稳定性的分析方法,样品,不含抗性标记抗生素平 板 培 养基,10-12h,100个菌落,含抗性标记抗生素 平 板 培 养 基,10-12h,统计生长菌落数,重复三次,计算比值(稳定性stability),4、影响质粒稳定的因素,与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响； 宿主对质粒稳定的影响； 质粒拷贝数； 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响。,5、使质粒稳定的措施,组建合适载体 选择适当宿主 施加选择压力 抗生素添加法 抗生素依赖变异法 营养缺陷型法 控制基
8、因过量表达 控制培养条件（温度、pH、DO）,为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法：先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的表达。由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。,（二）工程菌发酵工艺,基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。,1、工程菌培养的特点,工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。 为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细胞外分泌。 工程
9、菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代谢物，以保证细胞正常生长。,2、工艺要求,外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有： （1）培养基的影响 （2）接种量的影响 （3）温度的影响 （4）溶解氧的影响 （5）诱导时机的影响 （6）pH的影响,（1）培养基的影响,培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。 常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有
10、：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。,不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。 使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。 葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启动子有利。,在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的基因有影响。 无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。,（2）接种量的影响,接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。 接种量小，菌体延迟期较长，
11、使菌龄老化，不利于外源基因表达。 接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。,（3）温度的影响,温度对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。 温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。 适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。,（4）溶解氧的影响,对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。
12、 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。,（5）诱导时机的影响,对于PL启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（clts857），在2830下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录；当温度升高42时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动
13、转录，提高目的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109/个为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。,（6）pH的影响,pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。 如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳pH在6.87.4左右;培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳pH为6.06.5。,总之,最佳化的工艺是获得:最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速
14、度和最低失败率等。,基因工程药物制造实例,干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。型干扰素在分为1b 2a 2b等亚型。,1、基因工程菌的组建诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度获得寡A的mRNA 离心提取12s的 mRNA逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC,退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌 扩增杂交质粒筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选青霉素敏感细菌克隆 含干扰素c
15、DNA克隆将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌 中进行高效表达,2、基因工程干扰素的制备,启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提精提 半成品制备 半成品检定 分装冻干 成品检定 成品包装,2b干扰素生产过程 （1）发酵工程菌：SW-IFN-2b/E.coli DH5，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含1%蛋白冻0.5%酵母提取物0.5%NACl。摇床培养30 C，10h，发酵种子。15L发酵罐培养， 30 C，8h。然后42 C，3h。离心去上清。,o,o,o,（2）产品的提取与纯化湿菌超声破碎，离心，上清超滤浓 缩，Sephadex G50 分离。经SDS-PAGE检查。在经DE-52柱纯化。,3、质量控制标和要求,（1）半成品检定 干扰素效价测定 蛋白质含量测定 比活性 纯度测定 相对分子量测定 残余外源性DNA含量测定 残余血清igG含量测定 残余抗生素活性测定 紫外光谱扫描 肽图测定 等电点测定 除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。,（2）成品检定,物理性状 鉴别试验 水分测定 无菌试验 热原试验 干扰素效价测定 安全试验,（三）安全问题,关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。,
