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1、实验设计：实验设计：酶偶联反应测定血清中的肌酐一、广泛查阅文献、确定候选方法一、广泛查阅文献、确定候选方法：经过查阅相关文献，根据方法选择的要求对各种 方法进行比较，充分了解各方法的科学依据和真实的使用价值，再根据临床应用价值、实 验室条件等综合分析后，目前主要的肌酐测定方法有化学测定法(碱性苦味酸法)、酶法、 高效液相层析法、拉曼散射法、同位素稀释质谱法、毛细管电泳法及电极法等。二、候选方法设计：二、候选方法设计： 1、实验原理：肌酐经肌酐水合酶催化生成肌酸，肌酸与肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳 酸脱氢酶的级联催化作用下生成乳酸，并将 NADH 变成 NAD+，测量在 340nm 处 监测 NAD
2、H 吸光度变化速率，其降低程度与肌酐含量呈正比例，反应式如下P 教材 198 2、反应最适条件探讨：设计一系列实验分别探讨该候选方法的最适试剂浓 度、缓冲体系的种类、离子强度、pH 值、反应温度和时间、检测波长等。3、候选方法的初步试验：对候选方法做初步评价试验，包括：标准曲线和重复性；质控血清和新鲜标本的重复试验； 分析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比。 三、方法学评价三、方法学评价： （一）重复性试验（一）重复性试验：检测候选方法的随机误差。 批内重复性试验：目的是测定实验方法的偶然误差，但产生偶然误差的原因也 可能由于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性，吸量、计时、混匀等操作
3、缺 乏重现性造成，应排除这些因素才能把试验所产生的误差归于方法学的误差。 重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。方法学评 价重复性试验应由实验者作批内(或天内)及天间重复性试验 原理： 批内重复性试验是指在相同条件下(用同样的方法，同一种试剂和标 准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变) 对同一标本在尽可能短的时间内进行 m 轮，每轮 n 次重复测定，以获得批内精 密度数据的试验方法。其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观 评价 酶偶联反应测定血清中的肌酐随机误差的大小。 操作步骤：将血清标本用 酶偶联反应测定血清中的肌酐作 5 轮
4、，每轮4 次血糖测定， 即可获得 20 个测定数据。计算： 1按照批内精密度的计算公式计算 5 轮每轮 4 次测定值的平均数()、标准 差(S)和变异系数(CV%)。首先计算出每轮测定值的均数、标准差(Si)及方差 S12 S22 S32 、S 42。再 将 5 轮的总和代入公式即可算出批内标准差 Sw。最后计算出变异系数(CV%)。（二）回收试验：（二）回收试验：通过计算回收率，检测候选方法的比例系统误差试剂： 1血清标本 收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清，用酶偶联反应 测定血清中的肌酐，再用生理盐水稀释到一定浓度备用 2肌酐校准液 3生理盐水。 4其它试剂 同酶偶联反应测定血清中
5、的肌酐操作步骤：1样品制备基础样品： 血清 0.9ml + 0.1ml 生理盐水。回收样品：血清 0.9ml0.01ml 80mmol/L 肌酐标准液 0.09ml 生理 盐水。回收样品：血清 0.9ml0.06ml 80mmol/L 肌酐标准液 0.04ml 生理 盐水。回收样品：血清 0.9ml0.09ml 80mmol/L 肌酐标准液 0.01 生理盐 水。2血糖浓度测定 按酶偶联反应测定血清中的肌酐，每份样品作双份检测， 结果取平均值。计算: 1加入浓度计算:加入浓度(mmol/L)=标准液浓度 2回收量计算:回收量回收样品测得值基础样品测得值 3回收率计算:回收率(%)=100 请将
6、各计算结果填入表 2-4 内。 表 2-4 回收试验的数据处理样 品 测得浓度 加入浓度 回收浓度 回收率(%) (umol/L) (umol/L) (umol/L)基础样品回收样品 回收样品回收样品平均回收率。 ( (三三) )干扰试验干扰试验：通过计算干扰值，检测候选方法的恒定系统误差。 试剂： 1血清标本 收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清，用酶偶联反应测定血清中的肌酐，再用生理盐水稀释到一定浓度备用 2肌酐校准液 3生理盐水。 4其它试剂 同酶偶联反应测定血清中的肌酐操作步骤：1样品制备基础样品：血清 0.9ml蒸馏水 0.1ml。干扰样品：血清 0.9ml9.0mmol/L
7、肌酐标准液 0.05ml+蒸馏水 0.05ml。干扰样品：血清 0.9ml9.0mmol/L 肌酐标准液 0.1ml。血液样品：蒸馏水 0.9ml9.0mmol/L 肌酐标准液 0.1ml。 2肌酐值的测定 按酶偶联反应测定血清中的肌酐计算： 1干扰物加入值计算 干扰物加入值干扰物溶液浓度 2干扰值计算 干扰值(mmol/L)干扰样品测定值基础样品测定值 3干扰率计算 干扰率(%)干扰值/基础值100 计算结果请填入表 2-5 内。 表 2-5 干扰试验的数据处理 样品葡萄糖 测得值 加入值 干扰值 干扰率(%) (umol/L) (umol/L) (umol/L) 基础样品 回收样品 回收样
8、品 样品 （四）方法比较试验：（四）方法比较试验：检测候选方法的系统比例误差。 1、用允许分析误差（EA）和医学决定水平(XC)判断候选方法能否接受。 评价试验中得到的结果，经统计学处理就能得出各种误差值，将其与确定的 允许误差值EA进行比较。各项指标都小于EA，则表示该方法可以接受；任何 一项指标大于EA，则表示不能接受。 单值判断指标，可信区间判断指标 误 差 类 别 判 断 指 标 备 注 随机误（RE） 1.96STMEA STM：重复试验方法的 标准差 比例误（PE ）(|R-100|)(xc/100)EA R：平均回收率 恒定误（CE） |偏差|EA 由干扰试验测出 系统误（SE）
9、 |(a+bXC)-XC|EA 对比试验回归方程 总误差（TE） 1.96STM+|(a+bXC)-XC|EA 包括随机及系统误差 三、参考值与参考范围三、参考值与参考范围 从按若干标准规定的参考人群中选定一定数量的参考个体，通过检测所得 结果，经统计学处理求得均值（X）和标准差（S） ，均值（X）即为参考值，而 上述结果的 95%的分布区间（X2S）即为参考范围。 四、四、 临床诊断性能临床诊断性能 诊断试验评价四格表金标准诊断试验有病无病合计阳性真阳性真阳性(a)假阳性假阳性(b)a+b阴性假阴性假阴性(c)真阴性真阴性(d)c+da+cb+dN五、质控体系的建立五、质控体系的建立酶偶联反
10、应测定血清中的肌酐酶偶联反应测定血清中的肌酐实验原理：肌酐经肌酐水合酶催化生成肌酸，肌酸与肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶 的级联催化作用下生成乳酸，并将 NADH 变成 NAD+，测量在 340nm 处监测 NADH 吸光 度变化速率，其降低程度与肌酐含量呈正比例，反应式如下：P 教材 198 实验试剂：血清、R： 肌酐水合酶； R2 ：肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶操作步骤：连续监测法(340nm 处吸光度，其降低程度与肌酐含量呈正比例)加入物 B C U样品（ul） X 标准品（ul） X 蒸馏水（ul） X R1（ul） a a a混匀，在 37恒温 5min， R2 b b b混匀
11、，在 37恒温 5min,在340nm 处吸光度，其降低程度与肌酐含量呈正比例计算：样品肌酐测定（umol/L）= /min Cc Au Ac正常参考值：血浆肌酐 44-133mol/L。 注意事项： 1、此法特异性高，标本不需去蛋白，特别适用于自动分析。但工具酶过多、价格昂贵。 2、酶法具有线性范围宽、抗干扰能力强、重复性好等特点 3、血尿素浓度除受肾功能影响外，还受到蛋白质分解代谢引起的变化，如高蛋白饮食、胃 肠道出血、口服类固醇激素等都可使血尿素浓度增高。 4、样品为不溶血的血清、血浆（肝素或 EDTA 抗凝） 。样品应在低温条件下运输保存，样 品中 Crea 在 28保存可稳定 3 天，-20保存可稳定数月。 5、采用必要的预防措施适用试剂，试剂使用后应立即盖紧瓶盖，避免污染。 准确的结果取决于准确校正的仪器、温度及时间的控制。
