《（毕业论文）-流式细胞术分析黄连素对HepG2细胞细胞周期的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《（毕业论文）-流式细胞术分析黄连素对HepG2细胞细胞周期的影响（19页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、毕毕 业业 论论 文文 题题 目：目：流式细胞术分析黄连素对流式细胞术分析黄连素对 HepG2 细胞细胞周期的影响细胞细胞周期的影响 学学 院：院： 生生 命命 科科 学学 学学 院院 专专 业：业： 生生 物物 技技 术术 毕业年限：毕业年限： 2012 年年 学生姓名：学生姓名： 学学 号：号： 200874020129 指导教师：指导教师： 教教 授授 - 1 - 流式细胞术分析黄连素对流式细胞术分析黄连素对 HepG2HepG2 细胞细胞 细胞周期的影响细胞周期的影响 指导教师： （教授） （西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070） 摘要：摘要：目的 研究黄连素对HepG
2、2肝癌细胞细胞周期的影响。方法 用PI对黄连素处理的 肝癌细胞HepG2进行染色，用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果 黄连素作用于HepG2细 胞时，可将细胞周期阻滞在G2/M期，并且有“亚G1期”细胞的出现；抗氧化剂N-乙酰-L-半 胱氨酸（N-acetyl-L-cystein，NAC）降低了黄连素诱导HepG2细胞的凋亡率。结论 黄连素 可以诱导HepG2细胞发生凋亡,较高浓度的黄连素可以将HepG2细胞细胞周期阻滞在G2/M期， NAC可以降低黄连素诱导的细胞凋亡率，黄连素对细胞的毒性作用可能是通过氧化胁迫引起 的。 关键词：关键词：流式细胞术；HepG2 细胞；黄连素；细胞周期；细胞
3、凋亡 A flow cytometry study of The effect of berberine on cell cycle in HepG2 cell LIU Bing-Yan Tutor:LIU Guo-an (Professor) Abstract：objective To study the effected of berberine on cell cycle.Methods PI was used to dye the hepatocarcinoma cell disposed by berberine. The change of cell cycle were dete
4、cted by flow cytometry.results As disposed by berberine,the cell cycle were arrested in G2/M.There is an apoptotic peak appeared. N-acetyl-L-cystein reduce the apoptosis of HepG2 induced by berberine. Conclusion Berberine can inhibit proliferation of HepG2 by arresting cell in G2/M and inducing apop
5、tosis .NAC could reduce the rate of cell apoptosis induced by berberine.The toxic effects on cells of berberine may be caused by the stress of oxidation. Key words: Flow cytometry; HepG2 cell; Berberine; Cell cycle ;Cell apoptosis 肝癌是一种世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国占居民恶性肿瘤死亡的 - 2 - 第二位。全世界每年新发肝癌约 26 万例，占全部恶性肿瘤的
6、4.0，而 42.5 的肝癌分布在中国，中国肝癌死亡率为 20.4/10 万，占全部恶性肿瘤死亡的 18.81。由于肝癌起病比较隐匿，一经确诊往往已属晚期，故只能进行姑息性 切除或放、化疗。疗效也不理想。因此，临床上肝癌病人急需特异性的、有效 的新型抗癌方法。肿瘤发生的原因是相当复杂的，其中一个重要原因可能是细 胞凋亡的趋势减弱2。因些，促进肿瘤细胞凋亡，纠正失衡的机体内环境，是 抗肿瘤的一个重要方法。然而，细胞的凋亡受到很多种蛋白质分子调控，这些 蛋白质大致可分为促凋亡和凋亡抑制两种蛋白。 人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理 性的。有关细胞死亡过程的研究，近年来
7、已成为生物学、医学研究的一个热点。 细胞的死亡至少有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。细胞坏死是早已被认识 到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。 细胞凋亡是细胞的一种基本生物象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞 中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境稳定以及多个系统的发育中起 着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有复杂的分 子生物学机制以及重要的生物学意义。 1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中 有一些散在的死亡细胞，它们的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这 些细胞体积收缩、染色质凝集、从其周围
8、的组织中脱落并被吞噬细胞吞噬，机 体无炎症反应。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了 对细胞凋亡的真正探索的开始。在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的 研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。 形态学观察发现细胞凋亡的变化是多阶段的3。细胞凋亡往往涉及单个细胞， 即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消 失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性 改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约 180bp-200bp片段；胞膜有小泡形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜 结
9、构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外 溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细 - 3 - 胞吞噬。 细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现 象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180bp- 200bp的整数倍，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，表明染色体DNA恰好 是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段。实 验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核 小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异 的梯状
10、Ladder图谱，而细胞坏死呈弥漫的连续图谱。细胞凋亡的生化改变不仅 仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生 物大分子的合成作为调控因子。 细胞凋亡之所以成为人们研究的一个热点，在很大程度上决定于细胞凋亡 与临床病毒的密切关系。这种关系不仅表现在凋亡及其机制的研究，阐明了一 大类免疫病的发病机制，而且由此可以导致疾病新疗法的出现，特别是细胞凋 亡与肿瘤之间的密切关系倍受人们重视。 一般认为恶性转化的肿瘤细胞是因为失控生长，过度增殖，从细胞凋亡的 角度看则认为是肿瘤的凋亡机制受到抑制不能正常进行细胞死亡清除的结果。 肿瘤细胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活，并呈
11、过表达状态。这些基因 的激活和肿瘤的发生发展之间有着极为密切的关系。癌基因中一大类属于生长 因子家族，也有一大类属于生长因子受体家族，这些基因的激活与表达，直接 刺激了肿瘤细胞的生长。这些癌基因及其表达产物也是细胞凋亡的重要调节因 子。许多种类的癌基因表达以后，即阻断了肿瘤细胞的凋亡过程，使肿瘤细胞 数目增加。因此，从细胞凋亡角度来理解肿瘤的发生机制，是由于肿瘤细胞的 凋亡机制，肿瘤细胞减少受阻所致。从细胞凋亡角度和机制来设计对肿瘤的治 疗方法就是重建肿瘤细胞的凋亡信号转递系统，即抑制肿瘤细胞的生存基因的 表达，激活死亡基因的表达。 近年研究表明4，黄连素具有抗肿瘤作用，可诱导多种肿瘤细胞凋亡
12、。黄连 素又称小檗碱，是从黄连、黄柏、三棵针、唐松草等植物中提取的季胺类化合 物，是存在于小檗科、罂粟科、毛茛科、芸香科、防己科、鼠李科植物中的异 喹啉类生物碱，现已能够人工合成，具有抗菌谱较广、毒性和副作用较小等特 - 4 - 点，临床常作为抗肠道细菌感染类药物应用。黄连素作为抗菌药在临床上已应 用多年，其疗效确切，是一种广谱抗菌药物，对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳 性菌及真菌、霉菌、病毒、原虫、线虫具有抑制或杀灭作用。近年来在动物实 验研究及临床疗效观察中发现黄连素在临床上还有许多新用途，特别是肿瘤科、 心内科、器官移植方面的研究应用有新的发现。 有学者研究黄连素对人宫颈癌Hela细胞株的体
13、外作用，探讨其可能的作用 机制5。方法采用MTr法测定细胞生长抑制率；原位末端标记技术法(TUNEL)检 测细胞凋亡率；免疫细胞化学法检测药物作用前后细胞COX-2和Bcl-2蛋白水平 表达的变化。结果黄连素在体外对宫颈癌Hela细胞产生细胞毒作用并诱导其凋 亡；免疫细胞化学法证实黄连素作用Hela细胞后Bcl-2蛋白表达下调，COX-2的 表达无明显变化。得出结论，黄连素在体外对宫颈癌Hela细胞具有生长抑制作 用，并可诱导细胞凋亡，其诱导凋亡作用可能与Bcl-2蛋白表达下调有关。有人 探讨黄连素联合腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因(Ad-CD)对直肠癌细胞的 体外杀伤作用。结果发现黄连素可
14、以增强自杀基因系统对直肠癌细胞的杀伤作 用，可作为一种增效剂应用于直肠癌的治疗。史海岭等研究对黄连素作用后的 肺腺癌A549细胞的增殖、迁移及黏附能力进行了检测，结果发现黄连素能够抑 制A549细胞的迁移和黏附能力，其机制可能与下调MMP2和MMP9的mRNA表 达，从而降低其活性有关。 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集 计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分 析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表 面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进 行分
15、析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定 量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度大于95%。在血液学、免 疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发 生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定6。 （1）细胞形态变化 通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。在细胞凋亡早期， - 5 - 细胞前向角光散射的能力显著降低，90角光散射的能力增加；在细胞凋亡晚期， 前向角和90角光散射的信号均降低。此方法特异性不强，目前使用较少。 （2）细胞膜功能改变 磷脂酰
16、丝氨酸（phosphatidyl serine ，PS）异位：正常情况下，PS位于细胞 膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生 凋亡的早期事件。PS与Annexin（一种具有强力抗凝作用的血管蛋白）具有高 度亲和力。应用流式细胞仪采用FITC-Annexin/PI双染法进行细胞凋亡检测， 可同时描述三群不同状态细胞：FITC-Annexin-/PI-细胞，即正常活力细胞； FITC-Annexin+/PI-细胞，即凋亡细胞；FITC-Annexin+/PI+细胞，即已死亡 细胞。此种方法操作过程简单，指标敏感，应用者越来越多。 PI/Hoechst33342双染法：Hoechst33342（HO）是一种DNA的特异性荧光染 料，可通过完整细胞膜，应用PI/Hoechst33342可将细胞分为三群：正常活细胞 （HO强/PI-），凋亡细胞（HO弱/ PI-），（由于凋亡细胞发生DNA降解和丢
