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1、DNA Replication,第一节 基本概念,第二节 复制概况,第三节 DNA复制的酶学,第四节 DNA复制的半不连续性,第五节 DNA复制的过程,DNA复制亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。, 复制子（Replicon）；又称复制单位 或复制元,DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位1.3万 90万不等,二、复制起点、方式和方向,1、复制起点（origin 复制原点） 复制开始处DNA分子的特定位置,原核生物（Prokaryote）：单复制
2、起点即整个染色体只有一个复制单位,真核生物（Eukaryote） : 多复制起点 即一个genome中有多个复制单位,（2） 复制的多模式,单起点、单方向 （原核）,多起点、单方向 （真核）,多起点、双方向（真核）,Replication is Semi conservative,Semi-conservative is accomplished by separation of the strands of a parental duplex, each then acting as a template for synthesis of a complementary strand.,亲代
3、DNA,子代,子代,半保留复制,新合成的链,Semi-conservative,Semi-discontinuous replication,Okazaki fragments,半不连续复制：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3 5方向的母链作为模板指导新的链以5 3 方向连续合成， 另一股以5 3 为方向的母链则指导新合成的链以 5 3方向合成10002000个核 苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复制。,半不连续性复制（复制叉）,领头链 ( leading strand ),随从链( lagging strand ),冈崎片段（Okazaki fragm
4、ent）,领头链 leading strand 合成方向与复制叉解链方向相同，并可连续合成的子链。随从链 lagging strand 合成方向与复制叉解链方向相反，并且是不连续合成的子链。岡崎片段 okazaki fragment 在DNA复制过程中，随从链上初合成的不连续的DNA片段。半不连续性复制 在DNA复制过程中，领头链连续复制而随从链不连续复制。,1）模板(template)：解开成单链的DNA母链 2）底物(substrate)或称原料：dATP、dGTP、dCTP、dTTP 3）引物(primer)：复制需要一小段RNA作引物 4）能源：需ATP供能，原料dNTP本身也是高能化
5、合物 5）酶和蛋白质因子：DNA聚合酶(polymerase)等,参与DNA复制的物质及作用,RNA priming,The first few nucleotides at the 5-end of Okazaki fragments are ribonucleotides. Hence, DNA synthesis is primed by RNA that is then removed before fragments are joined.,解链酶（helicase）,作用：利用ATP供能，解开DNA双链消耗 2 ATP/解开 1 bp可随复制叉的伸展向前移动,拓扑异构酶（topoi
6、somerase，Topo）,Topo：拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持物体不变的性质 作用：松驰DNA超螺旋，克服扭结现象,拓扑异构酶（topoisomerase，Topo）,拓扑异构酶（topoisomeras） 转轴酶 拓扑异构酶 旋转酶 （gyrase）,切断DNA双螺旋中的一股，张力下降后封闭。切断DNA双链，使另一双链经过此缺口，再封闭。,单链DNA结合蛋白 (SSB)(single strand DNA bindingprotein),作用：能与DNA单链可逆的结合，其作用有二,也称：DNA结合蛋白（DNA binding protein，DBP),防止DNA复性 防止DNA
7、单链模板被水解,引物酶（primase）,模板 以DNA单链为模板 底物 NTP（ATP、GTP、CTP、UTP） 按碱基配对原则 （A = U G C） 按5 3 方向,作用：复制起始时催化生成RNA引物 本质：是一种RNA聚合酶（可以使两个游离的NTP聚合，此不同于催化转录过程的RNA聚合酶）,DNA连接酶,催化二段DNA链之间3,5 磷酸二酯键的形成,3 OH,5,5,3,O O- P OO-,有缺口的DNA链,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,O O P OO-,5,3,缺口封闭,缺口填补: 连接双股DNA分子中一链的缺口双链DNA分子中双链的缺口不能连接二分子单链DNA,应用:1
8、.岗崎片段之间的连接. 2.DNA损伤修复中的连接. 3.一种重要的工具酶:限制性内切酶切割后形成的粘性末端或平头末端的连接.,DNA聚合酶,DNA pol （DDDP） 主要作用：5 3的聚合活性,dTTP,3,DNA聚合酶,机理： 使核苷酸之间生成3，5磷酸二酯键主要作用： 5 3的聚合活性模板 以DNA单链为模板底物 dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物 以小片段RNA为引物注：引物的原料（ATP、GTP、CTP、UTP）按碱基配对原则 （A=T GC）按5 3 方向在 RNA引物的 3 -OH末端上开始逐个添加dNTP,领头链 ( leading strand ),随
9、从链( lagging strand ),冈崎片段（Okazaki fragment）,DNA聚合反应（新链生成）的特点,需要 模板,具方向性 新链的延长 5 3,需要 引物,E.coli大肠杆菌DNA聚合酶的作用,3 5 5 3外切酶 聚合酶,N,C,5 3 外切酶,小片段,大片段（ klenow片段）,切除RNA引物 损伤修复,校读功能,（常用的工具酶）,DNA聚合酶（DNA Polymerase）DNA指导的DNA聚合酶（DNA-Directed DNA Polymerase, DDDP）,聚合功能,DNA聚合酶全酶 （DNA Polymerase holoenzyme）,10种不同亚基
10、组成 2 DNA聚合酶 (4个) DNA聚合酶全酶,核心聚合酶 二聚体形式连接两个核心聚合酶 单个运载夹钳星环状,容纳DNA双链,DNA连接酶(DNA ligase),作用：消耗ATP，将随从链中相邻的两个DNA片段连接起来 催化同一模板DNA链上的两个相邻DNA片段的3端与5端间形成磷酸二酯键，把相邻的两段DNA连成完整的链,DNA replication,initiation, unwinding, elongation, termination & segregation,第三节 DNA复制过程 (起始、延长、终止）,确定复制的起始点 解开双链DNA,提供单链DNA模板 形成复制叉 DN
11、A合成的起始和延长 形成带有新合成的DNA片段的复制泡 复制的终止,Initiation,All the proteins and other factors for its complete replications,原核生物 双向复制 （型复制） 特定起始点：oriC,真核生物 多个复制单位（复制泡） （复制起始点+复制叉） 多个起始点,一.复制的起始,原核生物双向复制（型复制）,真核生物复制泡（复制起始点+复制叉）,oriC contains four 9 bp binding sites for the initiator protein DnaA. Synthesis of DnaA
12、 is coupled to growth rate so that initiation of replication is also coupled to growth rate. DnaA forms a complex of 30-40 molecules, facilitating melting of three 13 bp AT-rich repeat sequence for DnaB binding. DnaB is a helicase that use the energy of DNA hydrolysis to further melt the double-stra
13、nded DNA . Ssb (single-stranded binding protein) coats the unwinded DNA. DNA primase(引物合成酶） load to synthesizes a short RNA primer for synthesis of the leading strand. Primosome: （引发体）DnaB helicase and DNA primase,起始:形成复制叉replication fork需解决两个问题 DNA解开成单链，提供模板 合成RNA引物，提供 3 -OH末端,DNA复制的过程,解链酶 拓扑异构酶 SS
14、B 引物酶 DDDP- DDDP- 连接酶,起始延长终止,Topo,引物酶,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,Initiation,DNA双链复制起始点,dnaA,dnaB/dnaC,DNA双链解开成单链DNA,SSB,引物酶,RNA引物/3-OH,DNA聚合酶,dNTP,和3-OH形成35磷酸二酯键,解旋酶,解链酶,SSB,SSB,3,3,5,5,引发体,解链、 解旋酶,拓扑异构酶,1.在DNA聚合酶的作用下， 2.前导链合成1000-2000个核
15、苷酸后， 3.随从链开始合成，岗崎片段的长度 为1000-2000个（大肠杆菌） 4. Pol为不对称二聚体，一个作用于前导链，另一个作用于随从链(loop)。,复制的延长,延长: DNA-pol ( DDDP- )的5 3的聚合活性使核苷酸之间生成3，5磷酸二酯键模板 以DNA单链为模板 底物 dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） 引物 以小片段RNA为引物，在 RNA引物的 3 -OH末端上开始逐个添加dNTP 按碱基配对原则 （A = T G C） 按5 3 方向,DNA复制的过程,解链酶 拓扑异构酶 SSB 引物酶 DDDP- DDDP- 连接酶,起始延长终止,OH 3,
16、3,目 录,领头链的合成,目 录,领头链的合成,目 录,目 录,DNA polymerase III holoenzyme: a dimer complex, one half synthesizing the leading strand and the other lagging strand. Having two polymerases in a single complex ensures that both strands are synthesized at the same rate Both polymerases contain an a-subunit-polymerasee-subunit-35 proofreading exonuclease b-subunit-clamp the polymerase to DNAother subunits are different.,
