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1、构建表达红细胞生成素的细胞株 以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr- ）为宿主细 胞。将此细胞培养于100 mm 培养皿中，待细胞长满至50% 60% 时，用无血清细 胞培养基淋洗细胞，加入由无血清培养基、表达载体和共转化载体，以及 lipofectin组成的共转染混合液， 37培养 4 小时。吸出培养基，加入含10% 胎牛血清的 F12 培养基， 37培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10% 胎牛血 清的 DEME 中培养，获得抗性克隆。逐步提高MTX终浓度，筛选抗性克隆。利用 酶联免疫分析法确认所得到的细胞表达人红细胞生成素。12.6.3 CHO 细胞培养工艺过程
2、在获得了能够高效表达目的蛋白的重组细胞株以后，需要解决的问题就 是通过培养而大量生产出目的蛋白。 常规动物细胞培养的方法是将细胞放在不同 的容器中进行培养。 如利用转瓶大量培养贴壁细胞或用生物反应器培养贴壁或悬 浮细胞。 转瓶培养细胞工艺简单， 规模易于扩大， 污染易于控制， 一直用于疫苗 工业的生产， 是传统的细胞培养生产工艺。 美国 Amgen 公司是世界上最早获得人 红细胞生成素生产和上市的企业，采用的生产工艺即是转瓶培养生产工艺。以下 介绍生物反应器培养工艺。12.6.3.1 种子细胞制备 （1）冻存的细胞株 37水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。 （2）加入适量 DMEM 培养基（含
3、10% 小牛血清）。 （3）37二氧化碳培养箱培养，连续传三代。 （4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为2.5106个/ml 。12.6.3.2 反应器连续培养 （1）加入纤维素载体片及pH7.0 的 PBS缓冲液， 5L细胞反应器高压灭菌 1.5 小时。 （2）将反应器接入主机，连接气体，校正电极，排出PBS缓冲液。加含有 小牛血清的 DMEM 培养基，接种。控制条件pH7.0，搅拌转速 1.2105 IU/mg 。12.6.5 红细胞生成素的质量控制 12.6.5.1 红细胞生成素的活性检测 得到红细胞生成素纯品后， 测定纯度、 蛋白含量、 分子量等物理化学性 质和体内生物学活性。 红细
4、胞生成素的体外活性即免疫学活性，用酶联免疫分析试剂盒检测。 试剂盒内含有标准重组人红细胞生成素。将待测品稀释后，进行酶联免疫分析， 依照其 OD值，以内标法计算样品相对于标准品的活性。红细胞生成素的体内生物活性测定：采用网织红细胞计数法。选用6 8 周龄的同性别 BALB/c 小鼠分为三个计量组，每组两只。分别于腹部皮下注射 红细胞生成素标准品和稀释样品以2IU/ 只，4IU/ 只,8IU/ 只剂量注射；连续注射 三天后，眼眶取血，染色，涂片计数1000 个红细胞中的网织红细胞数，同时也 计算原血中的红细胞数， 两值相乘为原血中网织红细胞绝对数。以注射剂量为横 坐标，网织红细胞绝对值为纵坐标，求得待测样品的体内生物学活性，并计算样 品稀释前的浓度
