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1、第四章 微生物的生化试验和血清学试验,第一节 细菌的生化试验,一、概述,（一）、什么是生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。,（二） 检验细菌的生化试验范围,1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验 3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验,（三）生化试验的方法,在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。,（四）
2、生化试验的注意事项,1、待检菌应是新鲜培养物。培养1824h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑似菌落分别进行试验。,二、糖醇类代谢试验,（一）糖醇类发酵试验 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 （三）V-P试验 （四）甲基红（Methyl Red）试验 MR （五）七叶苷水解试验 （六）甘油品红试验,（一） 糖醇类发酵试验,1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇），有的只能分解12种糖醇 ，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖
3、醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。,常用的糖醇,单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇,2、试验方法：,用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置361.0 培养13天，每天观察结果。,3、结果观察和记录,记录： 产酸不产气，阳性，以“+”表示 产酸产气，阳性，以“”表示 不产酸产气，阴性，以“-”表示,气泡,导管,气泡,气泡,阳性,阳性,阴性,培养基变为黄色,培养基未变色、无气泡产生,（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验,1、原理
4、： 细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。,2、方法,取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37培养24h天，每天观察结果。,3、结果观察与记录,（三） V-P试验,1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V
5、P（+）反应。,2、试验方法,（1）奥梅拉（OMeara）法 （2）贝立脱（Barritt）氏法 （3）快速法,（）奥梅拉法：,将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 培养48h， 每1ml培养液加奥梅拉OMeara试剂0.1ml，摇动试管12min，静置于37恒温箱4h ，或在4850 水浴放置2h后判定结果。,（2）贝立脱法：,将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361培养2天，每2ml培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361 培养 4h ，如显现红色为阳性，呈黄
6、色或有类似铜色者，可判定为阴性。,（3）快速法：,将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。,3、结果观察与记录,（1）发酵管出现红色者，为阳性， 记V-P + （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P -,（四）甲基红试验（MR）,1、原理 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性 ；有
7、的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。,2、试验方法：,挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 或30 （以30 较好）培养35天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂12滴，立即观察结果。,MR-VP试验原理及照片,V-P,3、结果观察与记录,（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +； （2）呈橘黄色或黄色为阴性， 记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。,MR +,MR -,（五） 七叶苷水解试验,、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，
8、七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。,2、试验方法：,将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于361 培养24h,观察结果。,3、结果观察与记录,（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为 + （2）培养基不变色者，为阴性，记录为 -,（六） 甘油品红试验,1、原理： 某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。,2、试验方法：,取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于361 培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。,3、结果观察与记录,（1）出现紫色
9、或紫红色者,为阳性，记录为+； （2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-,复习题,1、什么是生化试验? 2、做生化试验要注意哪些事项？ 3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录 5、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录,（一）靛基质（吲哚）试验 （二）H2S试验 （三）尿素酶试验 （四）氨基酸脱羧酶试验 （五）苯丙氨酸脱氨酶试验(六) 明胶（Gelatin）液化试验,三、氨基酸和蛋白质代谢试验,（一） 靛基质试验,1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细
10、菌。,2、试验方法：,所用试剂: （1）柯凡克(Kovacs)试剂; 或 （2）欧波试剂,将待检菌小量接种于培养基中，于361 培养2448h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。,靛基质试验原理及照片,靛基质+,3、结果观察与记录,呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+ 无红色者，为阴性反应，记-,（二） 硫化氢（H2S）试验,1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。,2、试验方法：,挑
11、取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于361培养2448h，观察结果。,3、结果观察与记录,培养基底部呈黑色，为阳性，记+ 培养基底部无黑色，为阴性，记-,（三） 尿素酶试验,1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。,2、试验方法：,挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。,尿素酶试验图,阳性,3、结果观察与记录,培养
12、基变呈粉红色，为阳性，记 + 培养基颜色不变，为阴性，记 -,（四） 氨基酸脱羧酶试验,1、原理： 某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。,2、试验方法,取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在361 培养14天，每天观察结果。,3、结果观察与记录,试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记 + 试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记 -。,试验管,对照管,阳性+,阴性-,对照管变黄,试验管变黄,阳性反应试验管颜色变化过程,紫色黄色紫色 原理： 对照管呈黄
13、色，说明有细菌生长。在培养的早期（1012h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性，指示剂显紫色。,阳性反应试验管颜色变化过程： 紫色黄色紫色,（五） 苯丙氨酸脱氨酶试验,1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。,2、试验方法,从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在361 培养1824h后，加入氯化铁溶液45滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。,3、结果观察与记录,试验管立即出现绿色，为阳性，记 +
14、 无色为阴性，记 -。,加氯化铁试剂,出现绿色+,（六） 明胶液化试验,1、原理有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。,2、试验方法,挑取培养1824h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于361。另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置2030min后，再观察结果。,3、结果观察与记录,明胶液化，为阳性，+。 明胶凝固，为阴性，-。,复习题,1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项 2、简述硫化氢
15、试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项 3、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果的记录 4、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理,四、 有机酸盐和铵盐的利用试验,枸橼酸盐利用试验 丙二酸盐利用试验,（一） 枸橼酸盐利用试验,1、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。,2、试验方法,挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在361 培养14天，每天观察结果。,3、结果观察与记录,斜面有菌苔生长，培养基斜面变为
16、蓝色或深蓝色，为阳性，记+； 无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-,枸椽酸盐试验原理及斜面照片,阳性+,（二） 丙二酸盐利用试验,1.原理:某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。,2、试验方法,取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于361 培养48h，观察结果。,3、结果观察与记录,培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+; 培养基无颜色变化,为阴性,记-,五、 呼吸酶类试验,氧化酶试验 过氧化氢酶试验 硝酸盐还原试验 氰化钾试验,（一） 氧化酶试验,1.原理:氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。,试剂,1% -萘酚-乙醇液 1%盐酸二甲基对苯二胺,
