第四讲蛋白质的分拣

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1、第四讲,蛋白质分拣,我们的细胞每时每刻都在合成许许多多具有各种各样重要功能的蛋白质。它们究竟是如何越过细胞或细胞器的膜而到达正确的作用部位呢？ 1971年美国纽约洛克菲勒大学的Gunter Blobe 提出信号假说，他认为从细胞分泌的蛋白质含有内在的信号，使蛋白质到达和越过膜。 1975年Gunter Blobe通过精心设计的生化实验， 报道：这种信号是具有特殊序列，构成蛋白质整体一部分的肽。在信号肽的作用下，蛋白质可以越过内质网的通道。,4.1研究背景,1980年他提出了将蛋白质分拣导 向至特定的细胞部门的普遍原理。每个蛋白质在其结构中带有标明其细胞正确定位的信息。特定的氨基酸序列决定一个蛋

2、白将越过膜进入某个细胞器，还是整合到膜 内或从细胞输出。这些信号好比是行李上的标签，使行李能到达正确的目的地；或好比邮政编码，使信件能投递到正确的地址。这些信号序列实际上是位于蛋白质一 端或有时位于当中的氨基酸短链。,1999年Gunter Blobel因其发现蛋白质具有控制其运输和定位的内在信号的杰出贡献，获得诺贝尔生理学/医学奖。,蛋白质分拣（protein targeting)：蛋白质分类并转运到正确的细胞内部位的过程 蛋白质的正确分拣的条件: 一是蛋白质中包含特殊的信号序列（signal sequence）二是细胞器上具特定的信号识别装置（分选受体，sorting receptor）。

3、,4.2 蛋白质分拣的基本原理,蛋白质的分拣信号 靶向序列（ targeting sequence)，是蛋白质分子中一小段特异的氨基酸序列，又称信号序列（signal sequence) 靶向斑块（targeting patch)，是蛋白质分子中肽链折叠使互不连续的肽段相互靠拢而构成的局部立体结构。,signal sequence and signal patch,蛋白质在细胞内的运输形式 小泡介导:是附着在内质网上的多聚核糖体中合成的蛋白质的方式运输。 跨膜转运:是胞浆中游离的多聚核糖体中合成的蛋白质经跨膜到达线粒体或过氧化物酶体或进入细胞核。,膜泡运输的特点： 是内膜系统间的物质传递方式

4、运输高度定向 小泡以出芽或内吞方式生长 小泡表面具有一个笼子状的由蛋白质构成的衣被（coat）。这种衣被在运输小泡与靶细胞器的膜融合之前解体。,4.3 以小泡介导的方式运输,胞内膜泡运输沿微管或微丝运行，动力来自马达蛋白（motor proteins）。马达蛋白有3类： 动力蛋白（dynein），可向微管负端移动； 驱动蛋白（kinesin），可牵引物质向微管的正端移动； 肌球蛋白（myosin）,可向微丝的正极运动。,COP被膜小泡(COPcoated vesicle), 由外被蛋白(coat protein , COP )包裹的小泡。 COP 是一个复合体，包括：亚基。 COP被膜小泡主要

5、介导蛋白质从高尔基体运回内质网,包括从反面高尔基体运向顺面高尔基体,以及将蛋白质从反面高尔基体运回到内质网。,4.3.1 包被小泡的类型,由外被蛋白(coat protein , COP )包裹的小泡。COP 是一个大的复合体，称为外被体(coatomer) ，包括 Sec23/Sec24复合体，Sec 13/31复合体，Sec 16亚基， Sec 12亚基。 这种类型的小泡介导非选择性运输, 它参与从内质网到顺面高尔基体、从顺面高尔基体到高尔基体中间膜囊、从中间膜囊到反面高尔基体的运输。,COP包被小泡(COP coated vesicle),由网格蛋白包裹的小泡。 Clathrin的重链与

6、轻链组成二聚体，3个二聚体组成三腿蛋白，再彼此交联成网状结构。 网格蛋白形成的包被中还有衔接蛋白（adaptin）。它介于网格蛋白与配体受体复合物之间，起连接作用。已知至少有4种衔接蛋白，AP1,AP2,AP3,AP4. 网格蛋白包被小泡介导从反面高尔基体网络到细胞质膜、从细胞质膜到反面高尔基网络的运输。,网格蛋白包被小泡(clathrin-coated vesicle),4.3.2. 小泡形成的条件,参与小泡出芽形成的物质有 小GTP结合蛋白 外被体 衔接蛋白 膜受体蛋白等,小泡形成要有信号与信号受体 如KDEL信号是内质网蛋白的滞留信号, 因此KDEL是COP型小泡形成的信号，而其KDEL

7、的信号受体却是位于高尔基体的ERD2蛋白。,表- 衣被小泡的类型与功能,在大量进行内吞活动的细胞(如肝细胞、成纤维细胞)中,细胞质膜有许多网格蛋白小窝。 这些小窝的形成需要衣被召集GTP酶（coat-recruitment GTPase）、很多衔接子(adapter)和网格蛋白，小泡最后与质膜的脱离还需要一种称作发动蛋白(dynamin)的GTP结合蛋白。,4.3.3 小泡形成的机制,披网格蛋白小泡的形成,二、衣被形成,GTP酶（coat-recruitment GTPase），为单体GTP酶（monomeric GTPase），即G蛋白（GTP结合蛋白）。 GTP酶以两种状态存在: 同GTP

8、结合时, 具活性状态; 同GDP结合, 则是非活性状态。 GTP酶的活性和非活性状态的转变取决于两种蛋白: 鸟嘌呤核苷释放蛋白(guanine-nucleotide-releasing protein, GNRP), 它催化GDP同GTP的交换。GTP 酶激活蛋白(GTPase-activating protein, GAP), 它触发结合的GTP水解。,网格蛋白由相对分子质量为180kDa的重链和相对分子质量为3540kDa的轻链组成二聚体; 三个二聚体形成包被的基本结构单位-三联体骨架(triskelion), 称为三腿蛋白(three-legged protein); 许多三腿复合物再组

9、装成六边形或五边形网格结构,即包被亚基; 然后由这些网格蛋白亚基组装成披网格蛋白小泡。,网格蛋白(clathrin)及包被亚基(coat subunits),图 -网格蛋白的结构 (a) 网格蛋白的三腿复合物;(b)网格蛋白包被亚基;(c)披网格蛋白小泡。,图- 笼形蛋白的结构，A电镜照片，B分子模型，C衣被模型,衔接蛋白(adaptin, AP) 和发动蛋白(dynamin),衔接蛋白 在网格蛋白被膜小窝形成时, 网格蛋白和膜之间有一种蛋白质起衔接作用,这就是衔接蛋白。所以衔接蛋白是一种在披网格蛋白小泡形成中起中介作用的蛋白质。,图- 衔接蛋白与膜受体细胞质结构域中的信号序列相互作用,目前已

10、知有三种衔接蛋白:AP1、AP2和AP3。可分别结合不同类型的受体，形成不同性质的转运小泡。 AP1参与高尔基体内体的运输 AP2参与质膜内体的运输 AP3参与高尔基体溶酶体的运输,发动蛋白(dynamin) 发动蛋白是一种胞质溶胶蛋白,有900个氨基酸, 能够同GTP结合并将GTP水解。 发动蛋白的作用是在被膜小窝的颈部聚合,通过水解GTP调节自己收缩, 最后将小泡与质膜割开。,当笼形蛋白衣被小泡形成时，可溶性蛋白dynamin聚集成一圈围绕在芽的颈部，将小泡柄部的膜尽可能地拉近（小于1.5nm），从而导致膜融合，掐断（pinch off）衣被小泡。,披网格蛋白小泡的形成,披网格蛋白小泡的形

11、成分为三个基本过程 被膜小窝(clathrin-coated pit)的形成 在胞吞过程中, 吞入物(配体)先同膜表面特异受体结合 然后网格蛋白装配的亚基结合上去, 使膜凹陷成小窝状。,图9-68 披网格蛋白小泡的形成过程,披网格蛋白小泡的形成 网格蛋白被膜小窝通过出芽的方式形成小泡 小泡须在发动蛋白的作用下与质膜割离。 此时的小泡外面有网格蛋白包被, 称之被膜小泡。,图9-68 披网格蛋白小泡的形成过程,无被小泡的形成披网格蛋白小泡形成之后, 很快脱去网格蛋白的外被, 成为无被小泡。 在真核细胞中有一种分子伴侣hsp70充当衣被解体的ATP酶，一种辅蛋白（auxillin）可以激活这种ATP

12、酶。 披网格蛋白小泡的外被去聚合形成三腿复合物, 并重新用于披网格蛋白小泡的装配。,图9-68 披网格蛋白小泡的形成过程,Ca 2+ 参与了披网格蛋白小泡包被的形成和去被的过程。在形成包被时, 钙泵将Ca 2+泵出细胞外, 使胞质中的Ca 2+保持低浓度, 有利于有被小窝的形成。一旦形成被膜小泡, Ca 2+同网格蛋白的轻链结合, 使包被不稳定而脱去。,COP被膜小泡负责回收、转运内质网逃逸蛋白（escaped proteins）返回内质网。 内质网的正常驻留蛋白，不管在腔中还是在膜上，它们在C端含有一段回收信号序列（retrieval signals），如果它们被意外地逃逸进入转运泡从内质网

13、运至高尔基体cis面，则cis面的膜结合受体蛋白将识别并结合逃逸蛋白的回收信号，形成COPI衣被小泡将它们返回内质网。 COP I衣被小泡还可以介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。 介导 COP被膜小泡形成的因素有装配反应因子ARF、外被蛋白、膜结合受体蛋白、回收信号等。,COP被膜小泡的形成,装配反应因子(assembly reaction factor, ARF) 也是一种GTP酶，被认为是外被体外被的装配和去装配的信号。 当ARF同GDP结合时，游离存在于胞质溶胶中,若同GTP结合，GTP使ARF的构型发生改变，暴露出它的脂肪酸链，并随即插入到供体膜中。 同膜结合后的ARFGTP可以同外

14、被体结合，形成被膜小泡。,外被体蛋白质(coatmer protein, COP) COP是一种胞质溶胶蛋白质复合物,由7个亚基组成，包括、。COP在出芽小泡的胞质溶胶面聚合, 形成COP被膜小泡。,回收信号： 内质网腔中的蛋白，如蛋白二硫键异构酶和协助折叠的分子伴侣，均具有典型的回收信号Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL，图6-8）. 内质网的膜蛋白（如SRP受体）在C端有一个不同的回收信号，通常是Lys-Lys-X-X（KKXX，X：任意氨基酸），同样可保证它们的回收。,图- KDEL序列,图9-69 COP被膜小泡形成的过程,COP被膜小泡的形成 一种胞质溶胶中的小分子GTP结合蛋

15、白,即ARF,释放所结合的GDP,然后同GTP结合,形成ARF-GTP复合物,并整合在高尔基体膜中。GDP与 GTP的交换是由高尔基体膜中的一种酶催化的； COP同ARF以及高尔基体膜蛋白的细胞质部分结合； 在脂酰CoA(fatty-acyl CoA)的帮助下形成COP被膜小泡,但脂酰CoA的确切作用尚不清楚。一旦COP小泡形成就立即从供体膜释放出来，COP包被去聚合, 并与膜脱离, 这一过程是由与ARF结合的GTP水解所触发.,Cop I Vesicles,COP衣被小泡介导从内质网到高尔基体的物质运输。 由内质网到高尔基体的蛋白转运中，大多数跨膜蛋白是直接结合在COP II衣被上，但是少数

16、跨膜蛋白和多数可溶性蛋白通过受体与COP II衣被结合，这些受体在完成转运后，通过COP I衣被小泡返回内质网。介导COP衣被小泡的形成的因子有：衣被召集GTP酶Sar1蛋白、外被体蛋白(COP)、识别信号等。,COP小泡的形成,Sar1蛋白：作用类似COP小泡中的ARF。 外被体蛋白(COP)：COP也是多亚基的蛋白复合物, 构成的亚基有Sec23/Sec24、Sec13/Sec31、Sec16、 Sec12等。 Sar1GTP酶与Sec23/Sec24复合体结合在一起，形成紧紧包围着膜的一层衣被 Sec13/Sec31复合体形成覆盖在外围的一层衣被 Sec16推测可能是一种骨架蛋白，Sec12是Sar1的鸟苷酸交换因子。,识别信号： 在COP的小泡膜上有一个相对分子质量为24kDa的蛋白质帮助选择被运输的可溶性的ER蛋白。 COP小泡装配时的识别信号是双酸性分选信号(di-acidic sorting signal), 如Asp-X-Glu。这种信号序列与COP的一个或多个亚基结合。 另外,从ER形成的COP小泡常常相互融合成大的运输小泡,这种大的小泡需要以微管作为运输轨道向高尔基体运输。,