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1、1,临床免疫学实验诊断,实验诊断学,卫蓓文 交通大学医学院 检验系 Email: 63846590-776469,2,概述：免疫与疾病,3,免疫检验可分为两部分：一部分为利用免疫检测原理与技术检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质；另一部分是利用免疫检测原理与技术检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。,临床免疫学与免疫检验,免疫学技术的发展史,5,一、血清IgG、IgA、IgM 测定,IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，是血液和细胞外液中的主要抗体，也是机体再次免疫的主要抗体。成人5.6517.65g/L。IgA分为血清型和分
2、泌型，是参与黏膜局部免疫的主要抗体，主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。成人0.4 3.5g/L。IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，也是抗原刺激诱导的体液免疫应答中最早出现的抗体。成人0.53.0g/L。,6,测吸光度计算抗原或抗体的含量,抗体,抗原,免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正相关,免疫比浊法原理,7,血清IgG、IgA、IgM测定的临床意义,低Ig血症:先天性低Ig血症（免疫缺陷病）获得性低Ig血症(蛋白丢失)高Ig血症:多克隆Ig增高（感染）单克隆Ig增高（免疫增殖病）,8,血清IgD、IgE测定,正常人血清中IgD含量很低，膜结
3、合型IgD(mIgD)构成BCR，是B细胞分化发育成熟的标志。IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋白，主要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌，为亲细胞抗体，引起I型超敏反应；与机体抗寄生虫免疫也可能有关。成人0.1 0.9mg/L。,9,ELISA,原理（Principle）：将抗原或抗体结合到某固相载体表面，保持其免疫活性，测定时,把被测样品和结合物按不同的步骤与固相载体上的包被物反应。用洗涤的方法使与固相载体上形成的免疫复合物与其他物质分开，再加入酶反应底物，经酶的催化作用后底物变为有色产物。产物的量与标本中被检物的量直接相关。,间接法,间接法检测抗体,11,双抗夹心法示意图,双抗体夹心检测
4、抗原,13,血清IgD临床意义,IgD：生物功能不详增高：类风湿性关节炎、变态反应性疾病、 败血症、新生儿溶血病降低：意义不大,14,血清IgE临床意义,增高：变态反应性疾病、寄生虫感染、病毒感染、自身免疫性疾病。降低：意义不大,15,二、血清补体检查,补体：具酶样活性、不耐热的糖蛋白其存在与抗原性异物的刺激无关在正常人血清中含量相对稳定某些疾病时，含量及其活性可发生改变,16,补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点，称为CH50。,17,(图)血管神经性水肿,补体含量和活性相关的疾病,1免疫相关性疾病： 如自身免疫性疾病时，C1、C2、C3、C4和Hf等缺陷； 超敏
5、反应时（III型超敏反应），C3a、C5a等过敏毒素的产生。 2与补体有关的遗传性疾病：C2、C3缺陷导致的严重感染；与C1抑制物缺陷相关的遗传性血管神经性水肿SLE患者出现的细胞表面CR1缺陷与C1C清除障碍涉及I因子、H因子缺陷的肾小球肾炎；DAF缺陷引起的阵发性血红蛋白尿；C1q缺陷表现的严重顽固性皮肤损害，以及C1q、C1r、C4、C2缺陷造成的免疫复合物性血管炎（包括肾炎）等。,18,3补体含量显著降低的疾病： 消耗增多:免疫复合物形成导致的补体活化和消耗增多.如SLE. 补体的大量丢失:主要见于大面积烧伤、失血及肾脏病患者 补体合成不足:常见于肝脏疾病患者或营养不良的病人。 4高补
6、体血症：偶见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，正常妊娠时，也可观察到补体值的增高。,19,三、感染性疾病免疫学诊断,（一）病毒性肝炎 （二）细菌感染 （三）病毒感染 （四）真菌感染 （五）其他,20,（一）病毒性肝炎,甲型肝炎 乙型肝炎 丙型肝炎 丁型肝炎 戊型肝炎,21,1. 甲型肝炎病毒,22,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,Week,Response,Clinical illness,ALT,IgM,IgG,HAV in stool,Infection,Viremia,EVENTS IN HEPATITIS A VIRUS INFECTION,23,无论显性
7、感染还是隐性感染均能产生抗-HAV的 IgM和IgG抗体,抗-HAV的IgM在急性期和恢复早期出现阳性可作为甲肝的确诊依据,抗-HAV的IgG在恢复后期出现有保护作用，维持终身,甲型肝炎免疫学检测,2.乙型肝炎病毒,25,26,乙型肝炎免疫学检测,HBV具有三个抗原抗体系统：HBsAg与抗-HBsHBeAg与抗-HBeHBcHBcAg与抗HBcAg,27,1) HBsAg和抗-HBs HBsAg是HBV感染后第一个出现的血清学标志物。 HBsAg阳性见于急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。 持续6个月以上则认为转为慢性肝炎。 在急性感染恢复期可检出抗-HBs，一般是在HBsAg从血清消失后发生抗
8、-HBs血清阳转。,28,核心窗口期(core window):从HBsAg消失到抗-HBs出现的这段间隔期。此期可以短至数天或长达数月。 抗-HBs是一种中和抗体，是乙肝痊愈的一个重要标志。 抗-HBs对同型病毒的再感染具有保护作用，可持续数年。 抗-HBs出现是HBsAg疫苗免疫成功的标志。,29,2) HBeAg和抗-HBe 是HBV复制及血清具有传染性的指标。 在潜伏期与HBsAg同时或在HBsAg出现稍后数天可在血清中检出。 HBeAg持续存在时间一般不超过10周，如超过则提示感染转为慢性化。,30,抗-HBe出现于HBeAg阴转后，其出现比抗-HBs晚但消失早。 HBeAg阴转一般
9、表示病毒复制水平降低，传染性下降，病变趋于静止。,31,3) HBcAg和抗-HBc HBcAg是HBV存在和复制活跃的直接指标。 血液中的量微，不易检测到HBcAg。 抗-HBc出现较抗-HBs早得多，早期以IgM为主，随后产生IgG型抗体。,32,抗-HBc IgM为急性HBV感染的指标，但慢性乙肝患者也可持续低效价阳性，尤其是病变活动时。 急性感染恢复期和慢性持续性感染以IgG型抗-HBc为主，可持续存在数年。 抗-HBc不是保护性抗体，不能中和乙肝病毒。,33,34,35,乙型肝炎病毒抗原抗体系统检测结果分析,36,前S1蛋白(pre-S1)/抗pre-S1: 指位于HBV表面抗原蛋白
10、1-120位氨基酸,具有肝细胞特异的糖蛋白受体的功能。1.出现早,与HBeAg、HBV DNA显著相关;2. pre-S1和肝细胞结合,有助于病毒的入侵;3.干扰素疗效的标志;4.抗pre-S1预示预后,37,3. 核酸检测 血清中存在HBV DNA是诊断HBV感染最直接的证据，可用定性的核酸杂交法、定量分支DNA(branched DNA，bDNA)杂交法、定性PCR法、荧光定量PCR法检测。 HBV DNA检测可作为HBsAg阴性HBV感染者的的诊断手段，也有助于HBV感染者传染性大小的判断、HBV基因变异研究以及抗病毒药物临床疗效的评价等。 但是HBV DNA阳性、及其定量检测的拷贝数目
11、多少并不与肝脏病理损害程度呈相关关系，故不能用HBV DNA的多少判定病情程度。,38,思考题,患者一年前乙肝病毒感染血清标志的检测结果为,HBsAg(+), 抗-HBs(-), HBeAg(+), 抗-HBe(-), 抗-HBc IgM/IgG均(+), HBV DNA 4105拷贝/ml。治疗后此次复查结果为，抗-HBs（-），HBsAg（-），抗-HBe（-），HBeAg（-），抗-HBcIgM（-）/IgG（+），HBV DNA 6106拷贝/ml。其原因最可能是 A. 乙肝恢复期 B. 病毒发生变异 C. 试剂盒失效 D. 操作失误 E. 抗病毒治疗有效,39,3. 丙型肝炎免疫学检
12、测,免疫学：筛选试验 ELISA、放射免疫法抗HCV IgG或IgM。 抗HCV IgM早期诊断。 确证 免疫印迹法,40,根据与HBV感染的关系，可将HDV感染分为两种类型： 1. 同步感染(coinfection) 指与HBV同时或先后感染。同步感染可引起典型的急性病毒性肝炎，个别病例易发展为危及生命的重症肝炎。 2. 重叠感染(superinfection) 指在慢性HBV感染的基础上发生HDV感染。在重叠感染中，HDV复制水平较高，极易导致慢性乙型肝炎患者症状加重和慢性化，与肝硬化的发生也密切相关。,4.丁型肝炎免疫学检测,41,丁型肝炎免疫学检测,1）HDV抗原2）抗HDV IgM
13、3）抗HDV,42,HBV - HDV Coinfection,Typical Serologic Course,Time after Exposure,Titer,anti-HBs,Symptoms,ALT Elevated,Total anti-HDV,IgM anti-HDV,HDV RNA,HBsAg,HBV - HDV Superinfection,Typical Serologic Course,Time after Exposure,Titer,Jaundice,Symptoms,ALT,Total anti-HDV,IgM anti-HDV,HDV RNA,HBsAg,44,5
14、.戊型肝炎免疫学检测,抗体检测 IgM型：诊断指标，ELISA法 IgG型：双份血清，流行病学调查、既往感染或疫苗接种效果评价 病毒抗原,45,（二）细菌感染免疫学诊断,人感染病原体产生特异性抗体可持续一段时间，现症诊断，疾病追溯。 1.血清抗链球菌溶血素“O”试验：A群溶血性链球菌 近期感染，活动性风湿热、风湿性关节炎、心肌炎、急性肾小球肾炎、急性上呼吸道感染、皮肤和软组织的感染等 正常参考范围：胶乳凝集法500U免疫比浊法 200IU/ml,47,2、肥达反应利用凝集试验，作为伤寒、副伤寒的辅助诊断。正常参考范围：伤寒O凝集效价 4倍，诊断价值较大。,48,3.结核分枝杆菌抗体和DNA测定
15、：结核菌致病可能与免疫损伤密切相关（型变态反应）呈显感染免疫（有菌免疫）。免疫学检测：抗PPD-IgG （ELISA：阴性），结核菌素皮试（5mm15mm）。DNA检测：PCR,49,（三）病毒感染,ToRCH一组可通过宫内感染直接影响胎儿发育，并引起相似临床症状和体征如流产、或死胎、先天性畸形和智力低下等的感染因素。,50,“To”代表弓形体(toxplasma,TOX) “R”代表风疹病毒(rubella virua,RV) “C”代表巨细胞病毒 (cytomegalovirus,CMV) “H”代表单纯疱疹病毒(herps simplex virus,HSV),51,TORCH的应用,孕前(准备怀孕前双方) 孕早期 新生儿脐血 幼儿时 预防接种时,
