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1、实验五 肠道致病菌的微生物学检查 结核分枝杆菌的培养及形态观察,医学微生物学实验,实验内容： 1.肠道致病菌的微生物学检查 2.结核分枝杆菌的培养及形态观察（抗酸染色）,1.肠道致病菌的微生物学检查,（1）实验目的 Aaaaaaaaaaaaaaaa示教：常见肠道细菌,（2）常用培养基介绍 主要包括：麦康克培养基、伊红美蓝培养基、中国蓝琼脂平板、SS琼脂平板、双糖铁培养基,示教：伊红美蓝培养基双糖铁培养基,SS平板分离肠道病原菌的强选择培养基,成分和作用： 基础培养基：提供氮源和碳源 胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱。 乳糖，中性红（pH6.8-8.0，红
2、橙黄） ：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质菌落淡黄色；大肠杆菌分解乳糖产酸，菌落呈红色 病原菌:小,无色 非致病菌:大,红色,病原菌:透明,无色，小菌落 非致病菌:紫黑色,EMB（Eosin Methyl Blue)平板 分离肠道病原菌的弱选择培养基,克氏双糖培养基,接种方法 如何观察 上层含乳糖部分 乳糖发酵：致病菌红色，非致病菌黄色 H2S然后观察下层 发酵葡萄糖（产酸产气） 动力,乳糖 硫酸亚铁 固体 葡萄糖 半固体 指示剂:酚红,（3）肠道致病菌的分离鉴定 标本收集 分离培养 初步鉴定 血清学鉴定 生化反应,标本,选择鉴别培养基 SS平板,生化反应,血清学鉴定,已知Ab检测未
3、知Ag (玻片凝集试验),37,24h,？和球菌的不同,粪便标本肠道致病菌 分离鉴别流程,乳糖 葡萄糖 动力 硫化氢 大肠杆菌 黄色 + - 痢疾杆菌 红色 + - - 伤寒杆菌 红色 + + +/-,鉴别肠道致病菌的生化反应,糖发酵试验 甲基红试验 VP实验 枸橼酸盐利用试验 硫化物（硫化氢）生成试验 吲哚生成试验 尿素水解试验,示教：生化反应举例,糖发酵试验(fermentaton test),示教：单糖发酵管,甲基红试验（methyl red test）,- +,- +,VP（Voges-Proskauer）试验, +,+,-,Urease Test尿素酶试验 ：,H2S Product
4、ion硫化氢试验,- +,IMViC试验(Indole Test; Methyl Red (MR) Test; Voges-Proskauer (VP) Test; Citrate Utilization Test) 大肠埃希菌 产气杆菌 ,2.结核分枝杆菌的培养及形态观察发病趋势和临床意义：aaaaaaaaa,结核分枝杆菌,形态： 细长，略弯曲的杆菌，多聚集成团。无鞭毛,芽胞。 染色性： 不易着色，齐尼抗酸染色阳性。菌体呈红色，背景中其他物质蓝色。 培养特性： 专性需氧，最适37 ，营养要求高，生长缓慢，18h分裂一代。罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基含蛋黄、甘油、马铃薯、无
5、机盐、孔雀绿，26周可见菌落生长，菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色，不透明。在液体培养基，生长于表面，有皱褶。,结核分枝杆菌的培养方法,1痰标本培养前处理 （1）酸处理法：痰标本加入4硫酸稀释24倍，置室温下30min，期间振荡23次，使痰液化后即可接种。 （2）碱处理法：痰标本加入2氢氧化钠溶液稀释24倍，置37温箱内30min，期间振荡23次，痰液化后即可接种。 2接种培养法取上述处理过的痰液0.1ml均匀接种于改良罗氏培养基斜面，37孵育34周后观察菌落特点。,菌落为乳白色或米黄色，表面粗糙呈颗粒状或菜花状,抗酸染色,结核杆菌对苯胺染料一般不易着色，但经加温或延长染色时间后能抵抗3盐
6、酸乙醇的脱色作用。经此法染色后，结核杆菌及其他分枝杆菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。,示教：结核分枝杆菌抗酸染色,实验步骤： 1用竹签挑取开放性肺结核病人晨痰标本中干酪样小粒或脓性部分，或用取菌环挑取经酸、碱处理后的痰标本，置载玻片中央，均匀涂布成1.52.0cm卵圆形痰膜，干燥，固定。 2滴加石炭酸复红液于涂片上，玻片置于酒精灯火焰缓缓加热，至有蒸汽冒出，约维持5min（切勿沸腾或使染液干涸于玻片上）。如有染液干涸趋势，应补加染液。然后自然冷却，用流水漂去多于染液。 3滴加3盐酸乙醇脱色，至涂片较厚处无颜色脱出为止，约30s，水洗。 4滴加碱性亚甲蓝液复染1min，水洗。 5滤纸吸干后镜检。,实验材料 痰液1管/小组，抗酸染色染液1套/小组，玻片1个/人,实验报告内容抗酸染色法实验原理、实验步骤、实验结果绘图和结果分析。,
