植物线粒体基因组测序

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1、植物线粒体基因组测序 植物线粒体基因组的特征 1. 基因组大小变化大,结构复杂 2. 基因序列保守,基因组结构多变. 含有许多短的重复顺序,重复顺序的 重组常导致基因顺序发生重排 3. 来自叶绿体和核外源DNA的插 入, 线粒体基因向核内转移 4. 许多基因的连续性被内含子打断 5. 显著发生RNA editing 和反式剪 接(trans-splicing) 6.含有亚基因组环 烟草线粒体基因组: 含有 6 个额外 的 植物叶绿体基因组 1. 基因序列变异较快,基因组结构保守,基因顺序 稳定 . 2. 基因组大小变化不大,150K 左右 . 实验过程 (一)构建基因组DNA 文库步骤 1.用

2、 10g左右的新鲜组织,提取足量的总DNA (20ug). 2. 对随机断裂的基因组DNA 片断末端修复,形成 5 - 磷酸化的粘性末端. 3. 经低熔点琼脂糖凝胶电泳(LMP agarose),溶胶酶 溶解回收40kb 左右的片断 ,避开 UV, EB,不能过柱 ,. 4. 连入 CopyControl 的 pCC1FOS 载体中 . 5. 包被噬菌体蛋白,侵染大肠杆菌(EPI300 E.coli) 基因组测序常用大容量载体: PAC, BAC, 黏粒 (Cosmid) Southern 杂交 , 挑选含线粒体片段克隆 酶切 ,画出线粒体物理草图 构建总 DNA 文库 对目的克隆测序基因组序

3、列拼接 Fosmid 是黏粒的一种连接40Kb DNA 片段 Fosmid 载体的特点 单拷贝克隆产量低，高拷贝克隆稳定性差 1. 单 拷 贝 形 式 生 长 ,确 保 插 入 稳 定 和 重 组 DNA 的发生 . 2. 加入诱导物以后形成高拷贝克隆,每个细胞 中质粒的拷贝数可以达到50 个 (二)Southern 杂交挑选克隆步骤: 1.基因组 DNA 文库转膜 1. 基因组文库E.coli 铺平板 . 2. NaoH 法将克隆DNA 转移到尼龙膜上. 2.设计探针模板 3.非放射性探针的制备 1. 利用设计的印物PCR 扩增 ,得到每个 探针的模版序列. 2. 随机引物扩增试剂盒标记探针

4、模版. 4.免疫荧光反应及显影 1. 探针与尼龙膜上的克隆DNA 杂交 2. 辣根过氧化物酶(HRP) 与 Biotin 抗体结 合,经激发后 ,发出的光可以通过底片捕捉到. 3 . 根据亮点挑选克隆 4. 用相同的探针进行二轮杂交，直至准确挑出期望的克隆 5.描画线粒体基因组物理草图 探针模版 高温变性, 结合随机 引物 随 机 引 物 扩 增 , 结 合 biotin-14-dCTP 形成带标记的探针 polymerase biotin random primer 1. 所有克隆提DNA, 用 Hind III酶切 ,跑胶 ,转膜 . 2. 分别用 20 个探针与膜杂交. 3. 根据对每个

5、克隆分析结果画出物理草图, 挑选最终测序克隆 (三)对目的克隆测序 1. 鸟枪法测序 : 把所有线粒体基因组片断混合, 用超声波将DNA 随机打断成2.0Kb 的片段 , 克隆 ,10 倍覆盖测序 , 整体拼接组装. 优点 : 不用画物理草图 缺点 : 1. 物理 gap 的存在2. 误拼接3. 每个克隆的载体序列被测序 2. Primer Walking 法: 以每一个40Kb 的单个克隆DNA 为模版 , 黏粒末端引物起始, 每次 测序以后重新设计引物,直到把整个片段测完.把单个克隆测序以后拼接. Primer Walking 法 优点 : 1. 不用测载体序列 2. 拼接简便 ,准确 3. 费用低 4. 不需要特殊设备 缺点 : 需要设计合成大量引物 Fosmid 方法的优点和其他应用 1. 所需植物材料少 2. 用于线粒体和叶绿体基因组测序 3. 寻找基因 ,得到基因全长 4. 补齐基因组物理图谱的Gap