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1、实验五 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一、实验目的1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。二、实验原理考马斯亮蓝 G250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种,它与蛋白质的疏水微区相结合, 这种结合具有高敏感性。 它在酸性溶液中呈棕红色, 最大光吸收峰在 465nm,当它与蛋白质结合形成复合物时,其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝 G-250蛋白质复合物呈蓝色,在一定范围内,595nm 下光密度与蛋白质含量呈线性关系, 故可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法,本方法具有操作方便、 快速、干扰因素少的
2、特点。离心机的使用说明:1.要离心的离心管和管套要称重,重量不等时将水加在管套里。2离心管的放置是对角线放置,要求必须对称。3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后, 再定时间, 定好时间后缓慢旋转转速旋钮,使离心机均匀的提速到预定转速。分光光度计的使用说明:1.接通电源开关,预热20min 后,再选择须用的单色光波长。2.放入已加入溶液的比色皿,盖上样品室盖,推动试样架拉手,使对照比色皿(溶液装入45 高度,置第一格)置于光路上,调节100透射比按钮,使吸光度值A=0.00。3.推动试样架拉手,使样品比色皿置于光路上,读出吸光度值。4.测量完毕,取出比色皿, 洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。5.
3、电源开关置于“关”,拔下电源插头。三、试剂与器材:1. 试剂:(1)0.9NaCl:9g NaCl 溶解在 1L 的容量瓶中。(2)标准蛋白质:称取50mg 结晶牛血清蛋白定溶于50ml 容量瓶里。(3)染液:考马斯亮蓝 G-250 0.5g,溶于 250mL95%乙醇,再加入 500mL85(WV)磷酸,保存于棕色瓶中,称为母液。取150 mL 然后加蒸馏水定容到1000mL,保存于棕色瓶中,备用。2. 器材:试管;吸管 10mL、l5mL、lmL、0.1mL;722分光光度计四、 操作方法1. 标准曲线的制备取 6 支试管,按下表加入各试剂:以各管相应标准蛋白质含量(mg)为横坐标、 A5
4、95 为纵坐标,绘制标准曲管号 012345标准蛋白溶液(ml)00.20.40.60.81.00.9%NaCl 溶液(ml)1.00.80.60.40.20待测样品(ml)考马斯亮蓝试剂(ml)5.05.05.05.05.05.0摇匀,放置5min,测吸光度值A595nm线。2. 待测样品测定试管中加蛋白质样品1.0mL , 再加入 5.0mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂, 摇匀,放置 5min 后,在 595nm波长下吸光度值, 记录 A595。根据所测 A595 从标准曲线上查得蛋白质含量。并计算蛋白样品的浓度(mg/ml) 。五、实验结果及分析六、思考题蛋白质含量的测定还有哪些方法?其优缺点是什么?