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1、1 石蜡切片 HE染色 一、取材、固定： 取材： 厚度一般为 0.3cm(不应0.5cm)，面积一般为（ 1.0-1.5 ）cm x (1.0-1.5)cm 固定： 10% 中性福尔马林 、4% 甲醛、环保固定液 室温固定 18-48h 以后，流水冲洗 24h，臵于 70%80%乙醇中，可长期保存 ; 4度固定可延长至一周 . 二、脱水和包埋： （加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致） 1. 95% 乙醇 2-4h 2. 95% 乙醇 2h 3. 无水乙醇 1.5h 4. 无水乙醇 1h 5. 二甲苯 +无水乙醇（ 1：1） 20min 6. 二甲苯 10mi
2、n 7. 二甲苯 10min-(注：脱水透明时间可适当延长) 8. 浸软蜡（ 5052） （二道）各 30min 9. 浸硬蜡（ 5860） （二道）各 30min 10. 包埋：注意温度、切面。 三、切片： 修、切 4m 、展(40温水 )、贴、 烤（5560，26h）四、脱蜡至水： (脱蜡要彻底 , 时间宁长勿短 !) 11. 脱蜡：二甲苯 5-10min 二甲苯 5-10min 12. 脱苯：无水乙醇 3-5min 无水乙醇 3-5min 13. 水化： 95% 乙醇 85% 乙醇 75% 乙醇 50% 乙醇各 3min 蒸馏水 5min 2 次 五、染色： 14. 苏木素液染色 5 1
3、0min-(冬天可适当延长至20min) 15. 流水洗去苏木素液 1min-(用显微镜观察细胞核的苏木素染色质量, 调整时间 ) 16. 1% 盐酸酒精分化 1 3s 17. 水洗蓝化 1 2min 18. 返蓝（用温水或 1% 氨水） 5 10s 19. 流水冲洗 1 2min 20. 蒸馏水洗 1 2min 21. 0.5%伊红液染色 1 3min-(伊红液染色过深 , 可以 80-95% 乙醇分化 ) 22. 95% 乙醇分化 23. 蒸馏水稍洗 1 2s 六、脱水、透明，封片 24. 60恒温箱中烘烤 15min-(也可梯度乙醇脱水 , 但低浓度乙醇对伊红有分化作用) 或 二甲苯 2
4、X5-10min 脱水 25. 中性树胶封片： 苏木精（ hematoxylin ）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。 伊红（ eosin ）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。2 冰冻切片 HE染色 一、取材、 OCT 包埋、切片、固定： 1. 冰冻切片后 , 冰丙酮固定 10 30s-(可-80保存 ) 2. 稍水洗 1 2s 二、染色 3. 苏木素液染色（ 60） 30 60s -(冬天可适当延长至20min) 4. 流水洗去苏木素液 5 10s 5. 1% 盐酸酒精分化 1 3s 6. 稍水洗蓝化 1 2s 7. 返蓝（用温水或 1% 氨水） 5 10s 8.
5、流水冲洗 1 2min 9. 蒸馏水洗 1 2min 10. 0.5%伊红液染色 1 3min-(伊红液染色过深 , 可以 80-95% 乙醇分化 ) 11. 蒸馏水稍洗 1 2s 六、脱水、透明，封片 12. 60恒温箱中烘烤 15min-(也可梯度乙醇脱水 , 但低浓度乙醇对伊红有分化作用) 或 80% 乙醇 1 2min 95% 乙醇 1 2min 无水乙醇 1 2min 无水乙醇 1 2min 石炭酸 -二甲苯 2 3min 13. 二甲苯 5-10min 14. 二甲苯 5-10min 15. 中性树胶封固免疫组化 1X TBST: 取 100 ml 10X TBS 加 900 ml
6、 水稀释至 1升。加入1 ml Tween-20 ，混匀。 10X TBS ：在 800 ml 蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base, C4H11NO3）和 80 g 氯化钠（ NaCl） 。用浓盐酸将pH调节到 7.6 ，定容至 1 L 。1 X PBST: 配制时，取100 ml 10X PBS 加 900 ml 水稀释至 1 L 。加入 1 ml Tween-20 ，混匀。 10X PBS: 在 800 ml 水中加入 80 g 氯化钠（ NaCl）, 2 g 氯化钾（ KCl）, 14.4 g 磷酸氢二钠（ Na2HPO4）和2.4 g 磷酸二氢钾（ KH
7、2PO4） 。调整 pH到 7.4 ，定容至 1 L 。一、脱蜡至水： (脱蜡前将组织切片于60恒温箱中烘烤 20min) 二甲苯 5-10min 二甲苯 5-10min 100% 乙醇 3-5min 100% 乙醇 3-5min 95% 乙醇 3-5min 85% 乙醇 3-5min 75% 乙醇 3-5min 蒸馏水 5min 2 次-(脱蜡要彻底 , 时间宁长勿短 ! 残余的石蜡会有非特异性染色) PBS洗 3min X 3 次3 二、抗原修复： 封闭样本前进行1. 热修复：常用修复液： Tris/EDTA 修复液 (PH=9.0) , 柠檬酸修复液 (PH=6.0),1）高压修复：修复
8、液倒入高压锅，加热煮沸，放入切片，最大压力维持3min；关闭电源，冷水冷却高压锅，开盖，冷水冷却10min。2）微波修复：将切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液 (pH=6.0) 中，科研微波炉中高火煮沸后，调到中火，沸腾后继续加热10min自然冷却至室温。 PBS浸泡冷却 10min 。3酶修复： 胰蛋白酶消化法：浓度一般是0.05-0.1% ，酶预热后， 37C温育 15-30 分钟。胃蛋白酶消化法：浓度一般为0.04%，37C下温育 10-30 分钟。三、细胞通透、封闭：1. 细胞通透：1) 用 0.2%Triton X-100的 PBST孵育 30 min （RT避光） 。配法是用预热 4
9、0 ml PBS 加 120ul TritonX-100加热几分钟。2. 封闭内源性酶 ： （HRP 系统： 3% H2O2灭活； AP系统： 3%HAc 灭活。 ）2) 滴加 3%H2O2去离子水，室温 10min，消除内源性过氧化物酶活性。3) PBS溶液洗 3 次3 min 。3. 封闭内源性生物素 ：Endogenous Biotin-Blocking Kit, Invitrogen Cat. #E213904. 封闭内源性 IgG：4) 对小鼠抗小鼠的一抗时，需要用没有偶联物的抗小鼠Fab二抗封闭内源性 IgG 5. 血清封闭：5) PBS溶液洗 3 次3 min ；6) 将切片取出
10、 , 滤纸吸干周围水分 , 组化笔画圈 , 滴入 10% 血清（与二抗来源一致， PBS 稀释）或 1% BSA, 湿盒中室温 30-60 min ，倾去，勿洗。四、一抗孵育：甩去切片上的封闭血清 , 用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，从冰箱中取出需37 复温 45 min 。1) 多抗还是单抗：2) 即用型或浓缩型：3) 稀释倍数：全抗血清， 1/50；腹腔积液， 1/100 ；组织培养上清，不稀释4) 温度和时间：室温 1 小时，然后 4 度过夜，从冰箱中取出需37 复温 45 min 五、二抗孵育：1)将一抗倒掉并用含0.2%
11、吐温-20 的 PBS洗 5 min 3 次；2)滤纸吸去多余的水，加入已稀释的二抗后放入37 X 30 min 3)用 PBS洗 5 次5 min ；六、检测系统 : Biotin-Streptavidin-HRP检测系统： SP 、ABC 、SABC 4 聚合物（ Polymer）-HRP检测系统： MaxVision 、Elivision、EnVision4)滴加试剂 SP或 SABC 后，放入 37 X 30 min 。5)用 PBS洗 5 次5 min ；七、显色 ：辣根过氧化物酶： DAB （棕色）或 AEC （红色）作为酶底物显色。碱性磷酸酶： BCLP/NBT （蓝紫色）作为酶
12、底物显色。6)加入 DAB （快速滴入，观察染色，倒掉染液） ，显色时间控制在约5 min （310 min ） ，由镜下观察颜色控制时间。0.05 DAB （避光） （1:20 储备液） ：5 ul 20 DAB 0.1 ul 30% H2O295 ul PBS 。1%DAB 储备液的配制 : 50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS 充分溶解， -20 保存。八、复染、脱水、透明、封片7)用 PBS 3次3min 后，用双蒸水洗 5 min ；8)苏木素染色 1min，双蒸水洗 5 min ，再用 PBS返蓝 5 min ；9)脱水： 50%乙醇 3 min ，70% 乙醇
13、3 min ，95% 乙醇 3 min ，95% 乙醇 3 min ，100% 乙醇 3min 100% 乙醇 3min 10) 透明：二甲苯 5min 二甲苯 5min 11) 封片：中性树胶。注意事项1.苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。2.DAB 显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。3.抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4 度过夜。4.切片脱蜡和水化要充分； 加反应液时要覆盖组织充分； 每次加液前甩干洗涤液， 但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。5.片子着色不均匀的原因如下：脱蜡不充分。可以
14、60 烤 20 min ，立即放入新鲜的 xylene1 ；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/ 二抗等试剂；抗体孵育时，切片放倾斜；5 抗体孵育后 PBS冲洗不充分。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。6.一抗从 4 拿出后，为什么有人说要37 度复温，目的是什么？一方面，防止切片从4 直接放入 PBS易脱片；另一方面，使抗原抗体结合更稳定。 一般不需要 , 但对表达较弱的抗原可能有用,4 和 37 度时分子运动方式不同, 前者分子碰撞机率和运动速度小于后者, 后者结合更快 , 但敏感性也提高了并易造成非特异染色。7.切片染色后背景太深，不易区分特异
15、性与非特异性着色？抗体孵育时间过长、 抗体浓度高易增加背景着色。 这可通过缩短一抗 / 二抗孵育时间、 稀释抗体来控制；一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；DAB 显色时间过长或浓度过高；PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。1、无染色一抗和二抗不匹配：使用了针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。没有足够的一抗与目标蛋白结合：使用低稀释度抗体。延长 4 C 孵育时间（如过夜）。不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/ 二抗试剂盒失效：做阳性对照确认一抗/ 二抗试剂盒的有效性。靶组织中没有目标蛋白：参照抗体供应商
