EPO糖基化类型及作用

《EPO糖基化类型及作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《EPO糖基化类型及作用（29页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、EPO糖基化类型及作用韩云波 王佳彬70k生命基地沈阳药科大学主要内容（一）EPO的简介 （二）N-糖基化 （三）唾液酸对活性的影响 （四）新型EPO （一）EPO 简介3 人类 EPO 含有 166 个氨基酸 ,相对分子质量为34 400 ,有 4 个糖基化位点 ,其中 3 个 N-糖基化 位点(Asn24 ,38 ,83) 和 1 个 O -糖基化位点(Ser126) ,并有2 个二硫键连接。其中 60 %是蛋 白质 (单个多肽链) , 40 %为糖类。 糖基化对稳定 EPO 的体内活性具有重要作用 ,若 缺乏糖链 ,则 EPO 在体内迅速被水解而失活，而 在体外增强 。r HuEPO 的

2、一级结构、 Glu-C 酶解片段5EPO 简介3天然存在的 EPO 分为两种类型 , 型含 34 %的碳水化合物 ,型含 26 %的碳水化 合物。两种类型在生物学特性、抗原性及 临床应用效果上均相同。EPO 主要通过促 进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化 以调控红细胞的生成。EPO简介近年来研究显示，仅能进行N-连接而不能 进行O-连接的糖类对EPO功能的产生具有 重要意义.（二）EPO 的N -糖基化 研究表明 , EPO的 N -糖基化程度对 EPO 的体内 活性有相当大的影响。N -糖基化不完全的 rhEPO 体外活性正常 ,而体内活性则降低到体外活性的 1/500 ,其体内被清除的速

3、率也明显降低9。EPO 属于内源性物质 ,正常人体液中含量很低 ,半衰期 短。 rhEPO 与内源性 EPO的氨基酸序列完全相 同 ,仅糖基部分有微小的差别 10。rhEPO 比天然 EPO 含有更多的三天线及四天线低聚糖 ,并且二 者在唾液酸化程度上有明显的差别11,12 。 rhEPO糖基化性质与 rhEPO的生物学功能关系密 切 ,且是内源性 EPO与外源性 EPO的区别所在。 r HuEPO 中氮连接寡糖的结构 和类型 氮连接寡糖分为 3 种类型 ,即高甘露糖型、杂种 型和复杂型。rHuEPO 中氮连接寡糖为复杂型寡 糖。该类型寡糖在组成上可分为糖核部分、天线 部分及末端唾液酸部分。其

4、中糖核部分是固定不 变的 ,而天线部分可为二天线、三天线、四天线 , 最多只能为四天线 ,天线的组成为乙酰氨基乳糖 , 且可增加一个乙酰氨基乳糖单元 ,末端为唾液酸 , 唾液酸较易脱落。EPO 中的四天线寡糖是氮连接 寡糖中分子量比较大的。r HuEPO 中氮连接寡糖的结构 和类型通过 MALDI/ TOF MS 分析各个位点的 寡糖肽 ,表明二天线寡糖主要在 24 位点上 ,38 和 83 位点主要以多天线为主。国产 EPO 的寡糖唾液酸乙酰化的程度高 ,大部分寡糖的唾液酸都被乙酰化了，多天 线唾液酸乙酰化有助于 EPO 在体内的抗酶 解 ,降低代谢速率 ,提高生物活性。3个氮连接寡糖位点的

5、微不均一性 利用糖肽中肽段的辅助离子化作用 ,将唾液酸和寡 糖作为一个整体分析。将国产 rHuEPO 用 Glu-C 酶解 ,HPLC分离 ,ESIMS 在线监测含糖位点 , 并用在线 ESIMS 分析83 和 38 位点氮连接寡 糖的微不均一性 , MALDI/ TOF MS 分析了3 个糖 基化位点的寡糖的微不均一性。（三）唾液酸含量对其体内生物 学活性的影响8EPO 分子中糖含量与其体内生物学活性相关早 有报道6 。正常 EPO 分子内唾液酸含量约 10mol/molEPO7 。唾液酸存在于糖链的末端 ,有报道指出分子中唾液酸含量低的 EPO 分子 ,糖链末端的裸露 的半乳糖残基容易被肝

6、细胞上的受体所识别 ,从而 被肝细胞吸收分解 ,降低了体内的生物半衰期 ,是其 体内生物学活性低的原因7 。唾液酸含量对其体内生物学活性 的影响8 体内生物学活性低的EPO 的相对分子质量也较体 内生物学活性高的 EPO的低。推测是由于 EPO 分子糖基化不完全 ,特别是高分枝的糖链结构少 , 有效唾液酸化的糖链末端少 ,因而生物学活性低。 还有研究表明：糖链以4条分枝为主(完全由唾液 酸构成)的EPO，其活性相当于“标准”的EPO活性 ，而以2条分枝为主(完全由唾液酸构成)的EPO， 其活性在体外3倍多于“标准”EPO，而在体内则仅 为正常活性的15%。糖基化与生物活性关系4 采用间苯二酚显

7、色法测定 rhEPO 的唾液酸 含量; 网织红细胞法测定 rhEPO 的生物活性;并对 二者进行相关性分析。糖基化与生物活性关系1 唾液酸含量测定 间苯二酚显色法糖基化与生物活性关系 2 EPO 唾液酸含量与生物活性关系分析 以唾液酸与 rhEPO 蛋白比值为横坐标 ,以比活性为纵坐标 制作曲线 ,见图 1糖基化与生物活性关系糖基化与生物活性关系本次实验总结 随着唾液酸含量的增加 ,生物活性随之增 加 ,具有显著正相关性 ,但增加的幅度无一 定的规律; 当唾液酸/EPO 值 8.28 时 ,生物比活性 小于 120000IU/mg 。结论 成熟的重组人红细胞生成素 (rhEPO) 是由 166

8、个氨基酸残基组成的高度糖基化蛋白。 糖基化的程度对其生物活性有很大的影响 。通过实验 ,我们认为重组人红细胞生成素 唾液酸含量高低与其生物比活性具有显著 的相关性 ,当唾液酸含量低时 ,则生物活性 低 ,这与国内有关报道相符。正常 EPO 分 子内 ,唾液酸含量约 10mol/mol EPO 。糖基化对治疗蛋白性质的影响1治疗蛋白革命性地改变了很多疾病的治疗结果 , 但体内活性低和快速的消除限制了其使用。糖工 程是最近采用的一项新技术 ,通过改变与蛋白相连 的糖类来改变蛋白质的药代动力学性质。这一技 术已运用于促红细胞生成素 ,研制出一种促红细胞 生成素高糖基化类似物 DA(darbepoet

9、inalfa) ,它 含有 2 个附加的 N-连接糖类。在血清中的半衰期 增加了 3 倍 ,与重组人红细胞生成素比较 ,体内活 性增加 ,提高了蛋白质的稳定性、可溶性 ,并且减 少了免疫原性。（四）新型促红细胞生成素31 长效红细胞生成素2 EPO 融合蛋白3 其他促红细胞生成素1 长效红细胞生成素新红细胞生成刺激蛋白(NESP) 又称 Darbepoetin alfa ,Aranesp ,是美国 Amgen 公司研制的长效 EPO 制剂 ,于 2001 年 6 月底获 得欧洲药物评审委员会批准 ,用于慢性肾衰 (chronicrenal failure ,CRF) 引起的贫血。NESP 是一

10、种高糖基化 rhEPO 类似物(Hyperglycosylated rhEPO analogues) ,也是第 一个被批准用于临床的新型促红细胞生成素 ,具有 rhEPO 相似的作用机制即刺激红系造血。1 长效红细胞生成素NESP 含 5 个 N-糖基化位点及比 rhEPO 高 2 倍的唾 液酸残基 ,在一级结构中多了 5 个氨基酸和 N 端另外 2 个 糖基化位点 ,从而达到较大的代谢稳定性和3 倍于 rhEPO 的半衰期 (36 h , rhEPO 为 48 h) ,可减少给药次数。 NESP 常用剂量为 0. 52. 25g /kg ,皮下注射 ,每周 1 次 或隔周 1 次 ,12 周

11、为 1 疗程。其副作用与 EPO 相同。迄今为止尚未检测出 NESP抗体。期临床研究显示 ,慢性肾衰贫血病人使用Aranesp 可使血红蛋白水平增加至 11 g/ dl 。Macdougall (1999 年 ) 已应用于 CRF 贫血患者 ,Kotasek 等(2000 年) 和 Glespy 等(2001 年) 已应用于 CRA (化疗或不用化疗) 患 者 ,均取得了满意疗效 ,认为 NESP是一种安全、有效并有 应用前景的新的 EPO 制剂。2 EPO 融合蛋白 法国学者Dalle等 ,于2001 年利用基因重组技术合 成了一种二聚体 EPO ,由两个 EPO 及一个 9 肽 连接而成的

12、融合蛋白。 实验证明无论由化学交联还是由重组 DNA 介导 的编码区融合而获得的两个 EPO 分子的耦联 ,都 能得到比天然单体更稳定 ,体内寿命更长的蛋白。2 EPO 融合蛋白有些研究者试图构建表达 EPO 与其他细胞因子的 融合蛋白 ,如血小板生成素(Thrombopoietin ,TPO)与 EPO的融合蛋白 ,希望能作为肿瘤化疗的 辅助治疗药物 ,同时纠正红细胞贫血和血小板减少 症。3 其他促红细胞生成素 EPO 模拟肽是Wrighton等在 1996 年采用 噬菌体表面呈现技术在肽库中筛选出来的 20 肽 ,其相对分子质量远小于EPO 的相对 分子质量 ,但其生物功能与 EPO 基本

13、相同 , 能与 EPO 受体结合 ,激活后能引起一个与 EPO本身完全相同的细胞内信号机制 ,是一 个具有潜在应用价值的小活性肽。3 其他促红细胞生成素 EPO 模拟肽同天然 EPO比活性仍很低 ,且 相对分子质量很小 ,直接用于表达有较大困 难。 采用特定的限制性内切酶位点来构建串联 体 ,其优点在于可人为地控制串联体的大小 。从理论上讲只要不超出一定范围 ,可构建 4 串联体、8 串联体、16 串联体等任意大 小的模拟肽多聚体。参考文献1.Foreign Medical Sciences Section of Pharmacy 2006 Aug; 33(4) 2.JOURNALOFTIBE

14、TUNIVERSITY 2002 Sept; 17 (3) 3. ChinJ BiologicalsMarch 2004,Vo1.17 No.2 4.广 东 药 学 2003年第13卷第1期5.药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2000 ,35(10) :764 7696.Krantz SB , Fitzgerald FE , Chung E ,et al. Erythropoeitin. Blood , 1991 ,77(3) :419434.7. Sasaki H , Bothner B ,Dell A , et al. Carbohydrate structu

15、re of erythropoe2itin expressed in chinese hamster ovary cells byahuman erythropoeitincDNA. J Biol Chem ,1987 ,262(25) :12591276.8. ChinJ Biologicals 1999,Vo1.12.No.49. W asley L C, Timony G, Murtha P, Stoudem ire J, Dorner A J, Caro J, KriegerM, Kaufman R J. B lood, 1991, 77: 2624263210. L ipp i G, Guidi G. Clin. Chem. Lab. M ed. , 2000, 38 (1) : 131911. Tsuda E, Goto M, Murakam i A, Akai K, Ueda M, KawanishiG,Takahashi N, Sasaki R, Chiba H, Ishihara H. B ioche2m istry, 1988, 27: 5646565412. Berglund B, Ekblom B. J. In.t M ed. , 1991, 229 (2) : 125130Thank You!