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1、多重基因表达谱 基因表达 Gene Expression指基因片段(DNA)转录成mRNA及mRNA翻 译成蛋白质的过程. 基因表达调控n通常情况下，真核生物细胞只有2-15%的基因处于有 转录活性的状态。n表达调控是研究不同的环境和条件以及各种因素如何 令基因表达或不表达，而且按一定的时间、空间有次 序高效地运作。n调控水平： 转录、 转录后、翻译、翻译后n调控： 细胞代谢的调控（细胞生存、适应内环境）基因表达的调控（生命延续、适应大环境）n多水平的调控、多途径的调控n调控特点：复杂、多变、灵敏、准确基因表达分析n在以细胞为基础的生命单元中，遗传信息通 过转录由DNA 向RNA传递， 再通过
2、翻译向 蛋白质传递。在DNARNA蛋白质这样一 个信息流中，RNA是中心环节。n为了适应环境，生物必须对遗传信息流进行 调控；在多种水平调控中，最主要的调控作 用为基因表达水平调控mRNA 水平调控） ；n分子生物学及分子遗传学的发展,使人们对生物的 认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构特征, 分子生物学技术正在各个领域中被广泛应用, 而且 还将有更广阔的应用前景。伴随着线虫，小鼠， 人类以及其他生物基因组计划的完成，人类对生 命本质的研究已进入了后基因组时代。n如今基因表达研究的热点主要在于筛选与通路相 关的几十个至几百个差异表达的基因，这种分析 需要一种高通量的方法；n很多基因的表达调控
3、相互关联，形成复杂的基 因表达调控网络。通过检测这个网络中主要mRNA 表达水 平可以检测细胞生理活动，预测细胞、组织、 器官以至个体的生理/病理状态，进而可以直 接诊断和预测某些疾病。n基因组计划结果显示人类大约有3 万个基因 ，n但是每个细胞中只有大约1 万个基因表达，n只有大约10-500 个基因与特定的疾病相关 ，nDiscovery PhaseqWhole genome scanqModest sample setqID BiomarkersnSignature PhaseqFocused gene set (4-100)nTissue specificnDisease specif
4、ic nDrug response specificqIn depth studyqExpanded sample setGene Expression TrendThere are no 30,000 gene diseases No compound impacts 30,000 genes# of Samples100 1000 10,000 100,000 DiscoverySignatures# of Genes10 100 1000 10,000基因芯片(gene chip)n优势:高通量n缺点:成本高、数据量大n而对于一个信号通路，大约只有10-50 个基 因与之相关。Zembu
5、tsu的研究显示对于药物敏感反应，只有37 个 基因与之相关；Vant Veer 等在文章中指出只有70 个基 因与乳腺癌相关。因此多基因表达分析已经成为后基因 组时代的研究热点，这些研究涵盖了通过RNA 表达差异 寻找基因靶点，分析代谢途径，发现生物标记物；以及 RNA 干扰研究；药物特征研究；信号通路研究；基因表 达调控的监测等。逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)nRT-PCR是将RNA的反转录（RT ）和cDNA的聚合酶链式扩增（ PCR）相结合的技术。n首先经反转录酶的作用从RNA合 成 cDNA，再以cDNA为模板，扩 增合成目的片段。n优点: 1 灵敏、用途广泛：可用于检测 细胞中
6、基因表达水平，细胞中 RNA病毒的含量和直接克隆 特定 基因的cDNA序列。2作为模板的RNA可以是总RNA 、mRNA或体外转录的RNA产物 。n缺点：通量小，每次1-2个基因# of SamplesRT PCR100 1000 10,000 100,000 # of Genes10 100 1000 10,000ArraysDiscoveryMultiplex PCR (eXpress Profiling) SignaturesQuantitationHighLow基因组学和组学技术的发展 Technology Translation多重基因表达系统GeXP多重基因表达系统n多重RT-PC
7、Rn毛细管电泳Gene Expression Solution from sample to signaturesXP PCR Priming Processn1: Reverse Transcription mRNA to cDNAqReverse Chimeric Primers priming specific transcripts in Total mRNA preparation.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGene Specific PrimersUniversal Reverse Tag sequence 1、在RT 反应中，每个RNA 通过含有基因特异序列
8、的 杂合反向引物进行反转录为第一链cDNA。n2a Multiplex PCRqStep 1 of the reaction:nUniversal/Gene specific primers nCycle 1 to 3- gene specific primers worknSet gene ratiosUniversal Reverse Primer sequence added in RT stepGene 1 cDNAGene 2 cDNAGene 3 cDNAXP PCR Priming ProcessForward Chimeric Primer with Universal For
9、ward Primer Sequence2、在PCR 反应的前几个循环，含有基因特异序列的杂合引物起 作用；XP PCR Priming ProcessDye-Labeled Forward Universal Primer Unlabeled Universal PrimerUniversal reagents in reaction are in excess, driving amplification.3、在随后的PCR反应中，高浓度的通用引物起作用，统一扩增所有 目的片断； Capillary Electrophoresis Separation of Fragments by si
10、ze precise signal quantification. No clean-up!Unincorporated primers and fragments diluted, separated, data filtered, and ready for analysis. 01000020000300004000050000600007000080000150175200225250275300325350HuMulti2 SKL.A10_041223080BSize (nt)Dye Signal152.03157.70163.69172.03178.37186.76194.0220
11、2.13208.66214.60221.34227.33235.75242.76249.93255.07265.64272.83280.78286.14 294.16303.47314.63325.74340.69352.334、通用引物5末端标记有荧光，从而可以进行定量检测GenomeLab eXpress Profiler Softwaren3 Modules:neXpress DesignerneXpress AnalysisneXpress MapMultiplexing 1. 1. eXPresseXPress Designer Designer 2. 2. Design forwa
12、rd and reverse primersDesign forward and reverse primers a. a. 100 400 100 400 ntnt b.b.Size separation Size separation 3. 3. BLAST BLAST 4. 4. Confirm by running samples Confirm by running samples Process for XPTotal RNA 96-well formatGene Expression AnalysisRT Gene-specificMultiplex XP-PCRSample d
13、ilutionProduct OverviewBuilt on the strength of BEC Capillary Electrophoresis TechnologyGenomeLab GeXP Genetic Analysis System The multiplex primers are optimized to generate amplified, dye- labeled fragments- that are separated by Capillary Electrophoresis. in a size range of 150-350 nucleotides fo
14、r unambiguous gene identification. The amplification products are well balanced within a linear detection range of the CE system for precise signal quantification. Multiplex Gene Expression AnalysisGene numberExpected Size 1147 2154 3166 4173 5185 6192 7200 8209 9221 10228 11238 12246 13261 14279 15
15、289 16302 Kan325GenomeLab GeXP Genetic Analysis SystemGAPDHcyclophilin Abeta actin Reference genes are included to allow peak signal normalization for relative quantitative analysis Gene-specific peaks - identified, quantitated and normalized Gene expression profiles - created and visualized using proprietary software.n对多至30 重的RT-PCR 反应产物进行定量分析比 较，n将多重PCR 技术和毛细管电泳技术结合起来，n采用通用引物与特异引物相结合的方法，通过保 持反应体系中各模板DNA 的比例在扩增过程中不 变而实现多重PCR。Gene Expression Profiling of Seed Germination in Lettuce (PAG 2007) Signal FERT3238ferReceptorRegulatorIron deficiency
