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1、 高效液相色谱法：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：150-350*105 Pa高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）n n第三章第三章 高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法 HPLCHPLC（High Pertormance Liquid ChromatographyHigh Pertormance Liquid Chromatography，）n n2-12-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点一、
2、HPLC与GC差别1分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%2流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流
3、动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）1 1贮液罐（滤棒，可滤贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）去颗粒状物质） 2 2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵） 3 3进样装置进样装置 4 4色谱柱色谱柱分离分离 5 5检测器检测器分析分析 6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置n n二、高效液相色谱仪流程图二、高效液相色谱仪流程图三、HPLC的特点和实际应用1 1、利用其高柱效（、利用其高柱效（n=10n=104 4片片/ /米）
4、，有效分离极复杂米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。体系中的痕量组分。正相色谱分离有机溶剂中的物质正相色谱分离有机溶剂中的物质反相色谱分离水溶液中的物质反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。生化物质。 2 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子等）基酸、常见阴阳离子等） 3 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物。离高分子化合物。 4 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化、利用手性固
5、定相可以拆分分离具有手性的化合物。合物。2-2 基本理论和条件选择基础基础 理论理论n n热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论平衡理论平衡理论n n动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论VanderVander方程方程一、塔板理论一、塔板理论1. 1.二、速率理论（与二、速率理论（与GCGC对比）对比）2）涡流扩散项及其影响2. 2.讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）3）传质阻抗项及其影响 1 三、三、 影响分离的因素影响分离的因素1. 固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择：选粘度
6、小、低流速的流动相甲醇，约1ml/min 3. 柱温的选择：选室温250C左右四、四、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择一、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 二、液液分配色谱法（LLC）(liquid-liquid partition chromatography,chemical bonded phase chromatography 三、离子色谱法（IC）（ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 四、空间排阻色谱法（SEC）（
7、 steric exclusion chromatography2-32-3 各类高效液相色谱法简介各类高效液相色谱法简介1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异 分离前提：K不等或k不等一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSCLSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂2固定相：与LC比，固定相粒径不同（17% 分配色谱 硅胶失活载体吸附的水固定液1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用固定液极性NLLC固定液非极性RLLC 3正相色谱固定液极性 流动相极性
8、（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分反相色谱固定液极性 固定相极性底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR 5出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱 6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题） （三）正相键合相色谱 1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力 2固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3流动相：极性小（同LSC）底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k
9、 5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱 6适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等1反相离子对色谱法（IPC或PIC） 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱四丁基季胺盐分析酸 2）影响k的因素 a与m的极性有关（同反相色谱） b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱n n三、离子色谱法（三、离子色谱法（ICIC）2反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶
10、液调节流动相pH值，抑制 组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的 1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质pH一定的缓冲溶液 2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0pH8.0 破坏键合相与载体的结合pH3.0 腐蚀柱子 3）适用：极弱酸碱物质pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物2对流动相的要求：1）与固定液不反应 2）对样品有良好溶解度k=110k=25 最理想的 3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学 4）使用
11、粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气3洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）2-4 高效液相色谱仪1泵：恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用 2进样装置1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室） GC系统压力较小，可以HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀液相色谱3色谱柱：直径46mm,柱长1030cm柱效评价：色谱系统适应性试验R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗 4检测器1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高3）示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低，温度要求严格4）电化学检测器5）化学发光
