第七章 酶制剂生产

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1、第八章 酶制剂生产前言n20世纪20年代，法国人Biondin与Effront 在德国建厂生产枯草 杆菌淀粉酶来代替麦芽淀粉酶，用于棉布褪浆，为微生物酶的 工业生产奠定了基础。 40年代，抗生素工业兴起，深层培养技 术不久就被用于淀粉酶的制造，使酶制剂工业跨进了工业化生 产的时代。50 年代末，糖化酶成功用于葡萄糖生产，革除了沿 用上百年的酸水解工艺。 60年代中期，加酶洗涤剂大流行，进 一步促进了酶制剂工业的发展。70年代初固定化葡萄糖异构酶 用于生产果脯糖浆，大大推动了食品工业与酶制剂工业的发展 。随着酶制剂的普遍应用与固定化酶的广泛研究，促进了生物 催化技术与化学工程密切结合，诞生了一门

2、新学科酶工程n1971年在美国召开第一次国际酶工程会议，把大规模生产、分 离提纯、固定化技术、酶反应器设计，以及酶的工业应用都纳 入了酶工程的范围，并成为当时（20世纪70年代至80年代中期 ）初生物技术五大技术体系中最活跃、发展最快、成效最大的 一个体系。第一节 酶制剂的工业化生产n一、工业化酶制剂生产的优点n自1894 年米曲霉高峰淀粉酶 问世，1923年枯 草杆菌-淀粉酶工业化应用以来，微生物酶 制剂工业逐渐发展成为一个新兴的产业部门， 发展势 头方兴未艾。目前的800多种商品酶中 ，大多数是利用微生物生产的。n利用微生物发酵法大规模生产酶制剂，具有以 下几个明显的优点。优点n（一）酶的

3、品种多，新酶种易得n微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都 能从微生物中得到；倒是有许多酶目前还只在微生物 中发现，而未能从动植物中找到。n（二）菌种易诱变，代谢易调控n微生物代谢方式各种各样，又极易受外界因素的影响 ，很容易通过诱变等简便的育种方法改变原来的代谢 途径，得到预想的代谢途径，实现代谢的人为调控。n（三）生产周期短，酶的产量大n 微生物细胞构造简单，没有分化的营养器官，而是以 细胞表面直接与环境接触，所以代谢速度比高等生物 快得多，其繁殖速度快，生产效率高，生产周期短， 培养简便，并可通过控制培养条件提高酶的产量。相 比动植物组织酶提取，不受动植物原料量和来源的约 束，周

4、期短，产酶量大n（四）基因易操纵，优质种易得n 基因工程技术中，以微生物为对象的研究水平远远领 先于动植物，进行微生物的基因改造要比动植物方便 得多，技术水平也成熟得多。生物技术在酶工程中的 应用（如多拷贝酶基因的菌种）远远领先于其他工程 体系，早已产业化，并产生了巨大的经济效益和社会 效益。二、酶制剂生产的基本工艺流程n（一）基本工艺流程图n微生物发酵法生产酶制剂，分固态发酵法、液态发酵 法和载体发酵法三大类。由于载体发酵法还没有用于 大规模生产，以介绍固态发酵和液态发酵为主。n虽然因为具体的生产菌不同、目的酶不同、生产设备 不同、生产条件不同，采用的工艺有所不同，但酶制 剂生产基本工艺流程

5、大致如图8-1工艺要点1. 固态发酵法 （1)原料处理 碳源,淀粉质;氮源,麸皮 (2)菌种培育与接种：液体、固体等 (3)无菌要求 相对较低 (4)发酵工艺 控制好温度和湿度， 不需 要调节PH (5)提取纯化 成熟曲烘干、粉碎、过筛 ，得到粗酶粉。精制则加水抽提，分 离去除固形物，浓缩，盐析或有机溶 剂沉淀，离子交换层析进一步纯化。 2. 液体发酵法 （1)原料处理：葡萄糖等单糖为碳源 (2)菌种培育与接种：液体培养，几级罐 (3)无菌要求 要求较高 (4)发酵工艺 控制PH、温度、通风量 (5)提取纯化 真空浓缩得酶液。精制则 加水抽提，分离去除固形物，浓缩， 盐析或有机溶剂沉淀，离子交

6、换层析 进一步纯化第二节 淀粉酶 n淀粉酶是水解淀粉物质的一类酶的总称，广泛存在于 动植物和微生物中。它是最早实现工业化生产并且至 今为止应用最广、产量最大的一类酶制剂。n按照水解淀粉方式不同，可将淀粉酶分为四大类： 淀粉酶、 淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶（异淀粉 酶）。n此外，还有一些与工业有关的淀粉酶如环化糊精生成 酶（这种酶可使6、7个葡萄糖构成环化糊精）、G4、 G6生成酶（可从淀粉非还原端切割下4-6个葡萄糖分子 构成寡糖），还有-葡萄糖苷酶，又称葡萄糖苷转移 酶（可将游离葡萄糖转移到其他葡萄糖基的-1,6 位 上，生成含-1,6糖苷键的寡糖）。一、 -淀粉酶n工业上大规模生产和应用

7、的-淀粉酶主要来自细菌和 曲霉，特别是枯草杆菌，我国淀粉糖化工业使用的液 化酶BF-7658 、美国的enase 等属于这一种 。n由微生物制备酶制剂，产酶量高，易于分离和精制， 适于大量生产。当然亦能从植物和动物 中提取- 淀 粉酶，满足特殊的需要，但由于成本高，产量低，目 前还不能实现工 业化生产。具有实用价值的-淀粉 酶生产菌列于表8-1n由于菌种不断的选育改良，现在工业生产上用的菌种 产生-淀粉酶的能力已是原始菌株的数倍乃至数十倍n霉菌-淀粉酶大多采用固体曲法生产:麸皮为主要原 料，米糠或豆饼的碱水浸出液，以补充氮源;32-35 培养36-48h,40 烘干或风干,粗酶n细菌淀粉酶则以

8、液体深层发酵为主:以麸皮、玉米粉、 豆饼粉、米糠、玉米浆等为原料，补充无机氮源,此外 还需添加少量镁盐、磷酸盐、钙盐等。37通风搅拌 培养24-28h,离心或以硅藻土作助滤剂除去菌体及不溶 物。在钙离子存在下低温真空浓缩后，加入防腐剂、 稳定剂以及缓冲剂后就成为成品。这种液体的细菌- 淀粉酶呈暗褐色，带不愉快的臭味，在室温下放置数 月而不失活。n为制备高活性的-淀粉酶，并使贮运方便， 可把发酵滤液用硫酸铵盐析或有机溶剂沉淀制 成粉状酶制剂，最好贮存在25以下，较干燥 、避光的地方n枯草杆菌BF-7658是我国产量最大、用途最广的一种 液化型-淀粉酶，其最适pH6.5左右， 最适温度 65n多次

9、物理、化学诱变后获得一株11-12菌株，酶活力 比原菌株提高50%，在马铃薯培养基中生长良好n孢子斜面培养：马铃薯培养基50mL，37,72hn种子培养：标准夹套罐（500L，直径70cm,高 160cm)，371 ，罐压0.5-0.8大气压，通风量 0-10h，13.5m3/h;10-14h,17.5m3/h.培养12-14hn大罐：3000L标准罐，低浓度发酵，高浓度补料， 基础料：补料体检：3:1n工业上回收- 淀粉酶常用盐析、有机溶剂沉 淀和淀粉吸附三种方法。其中盐析法在工业中 用得比较普遍n用于盐析- 淀粉酶的中性盐有硫酸铵、硫酸 钠等。其中以硫酸铵最为常用，因为此盐的溶 解度较大。

10、二、-淀粉酶n-淀粉酶过去主要是从麦芽、大麦、甘薯、大豆等高 等植物中提取。近几年来，发现不少微生物能产- 淀粉酶，微生物的-淀粉酶从其对淀粉的作用上来看 ，与高等植物的-淀粉酶是一致的，而在耐热性等方 面都比高等植物更适合于工业化应用。n 目前，对产-淀粉酶菌种研究较多的是多黏芽孢杆 菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌和 链霉菌等。它们有可能发展成为微生物-淀粉酶的生 产菌种。n由于异淀粉酶和-淀粉酶可以相互配合使用，可以筛 选同时具有这两种酶的菌种。据报道，日本从土壤中 分离到蜡状芽孢杆菌蕈状变种，在所培养的条件下， 可以同时产生-淀粉酶和异淀粉酶。-淀粉酶生产过程n菌种：巨大芽

11、孢杆菌，耐热性n发酵培养基：淀粉3%，葡萄糖0.5%，蛋白胨1%，玉米浆1%，磷酸 氢二钾0.5%n34搅拌培养48h，酶活：25.5U/mLn发酵液8000r/min 离心20min,除菌体，加硫酸铵沉淀得粗酶，n0.01moL/L醋酸盐溶解，自来水透析3d,加25%醋酸铅溶液，离心除 去沉淀杂质，n硫酸铵盐析较纯-淀粉酶，酶活：100U/mLn总收率50%n近十几年来，国内外的微生物工作者在菌种的诱 变和发酵条件等方面都做了大量的研究工作。例 如，日本人新家龙把蜡状芽孢杆菌Bg10 用紫外线 处理后，获得的变异株产-淀粉酶的能力比亲株 提高约25-30倍。此菌株不需要淀粉诱导物， 在 不含

12、碳源而含0.5%牛肉膏的基础培养基中，也可 以生成- 淀粉酶；钾离子可提高酶的生成量， 麦芽糖反而抑制-淀粉酶的生成。n日本天野制药公司采用多黏芽孢杆菌ATCC8523生产- 淀粉酶时，使用高浓度碳源的培养液，最初温度为36- 40，等到对数生长期后，降温至30-34 ，继续进 行发酵，60h后, 淀粉酶的生成量为105U/mLn高浓度碳源培养液的配方为：薯淀粉10%、硫酸铵 0.75%、玉米浆0.5%、酵母膏0.2%、磷酸氢二钾0.1%、 硫酸镁0.75%、水0.05%三 糖化酶n糖化酶的生产菌种各国不一。美国主要采用臭曲霉 ， 丹麦主要采用黑曲霉，日本主要采用拟内孢霉和根霉 ，前苏联则主要

13、偏向研究拟内孢霉。我国糖化酶的生 产也主要采用黑曲霉作为菌种黑曲霉液体深层通风培养法生产糖化酶n在用黑曲霉生产糖化酶的初期，产品主要应用于由淀 粉制取葡萄糖。糖化酶的工业生产虽始于1965 年，但 当时菌种活性较低，发酵单位不高，因而成本过高， 不易开发应用。1977年中国科学研究所选育出黑曲霉 变异株UV-11，但其深层发酵要求高速搅拌及需用玉米 浆等条件，因而当时在生产中全面推广还有很大的困 难。n1978年无锡轻工业学院进一步选育菌种和研究培养条 件，以提高糖化酶发酵的活性。经多年的努力，完成 中试并通过鉴定。1981年起组织推广并开发应用于酒 精、白酒工业生产中。由于该成果的经济效益显

14、著， 年获国家科技进步一等奖。n斜面培养：查式培养基，31培养6-7d,n种子罐：2m3不锈钢，配方：玉米浆4%，豆饼粉3%，麸 皮1%，转速320r/min ,31-32 培养，罐压0.5大气压 ，通风量0.5/min（v/v),培养30-40h,酶活：300- 500U/mLn发酵罐：20m3，配方：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1% ，糠油5L，PH4.0，转速180r/min ，30-32 培养， 罐压0.5大气压，通风量:0-12h,0.5/min（v/v), 12-14h,0.8/min, 24-84h,1/min,84h后,0.8/min,发酵工艺控制nPH:控制4.0，方法：

15、磷酸盐、碳酸盐、醋酸 盐、氢氧化铵，含氮有机物、碳水化合物等的 比例来调节n溶氧：中间补料，基础料：补料体积：3:1,2- 3次补料，改善发酵通风比，需氧满足，酶活 增长n发酵工程（大生产）操作是控制罐内培养液的体积（ 以调节培养基配比）以及总残糖、PH、镜检等一些关 键项目，所得结果如表8-6四、异淀粉酶n 异淀粉酶也称为淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、R- 酶、茁霉 多糖酶等。异淀粉酶可以分解支链淀粉中的-1,6葡 萄糖苷键，生成直链淀粉。n此酶最早由日本的西村资治于1930年在酵母抽出液中 发现。此后又在茁霉和产气杆菌中发现。另外，此酶 在马铃薯、蚕豆、麦芽、稻米等高等植物中也有发现 ，但是不

16、稳定，活性弱，不适于工业应用。n此酶的碘反应是由赤变蓝。不同来源的异淀粉酶酶学 性质有一定的差异，如表8-7所示：n20世纪70年代以后，美国Staley 对产气杆菌生成异淀 粉酶的培养条件做了深入地研究。他们认为，培养基 的PH应维持在6.0-8.1，若在6以下或8.1以上，则酶产 量下降，即使调回PH ，此酶也不能产生；必须用麦芽 糖、麦芽三糖或茁酶多糖诱导；诱导的细胞可培养在 含有适当碳水化合物和植酸盐滤物或玉米浆培养基中 。只有保证以上3个条件才能生成异淀粉酶。n日本的宫本武明等除用10%可溶性淀粉外，还添加0.5% 谷氨酸钠使酶活力提高。再添加硫酸铵0.5%、磷酸氢 二钾0.05%、七水硫酸镁0.05%、七水硫酸亚铁0.001% 等无机盐，酶活力可达772U/Ml.n n另外，据Harwath等报道,麦芽糖醇可以促进微生物形 成异淀粉酶。我国异淀粉酶的研究工作开始于1973年 。异淀粉酶生产举例n菌种：产气气杆菌n斜面培养基：葡萄糖1%、牛肉膏1%、