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1、临床免疫检验质量保证卫生部临床检验中心 李金明定 义n质量保证(Quality Assurance,QA) 为一产品或服 务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计 划的和系统的措施。 n室内质量控制（Internal Quality Control,IQC) 由 实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评 价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本 实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、 批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠 、可否发出报告的一项工作。 定 义n室间质量评价 （External Quality Assessment, EQA ） 为客观比较一实验室的测定结
2、果与靶值的差异，由 外单位机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实 验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间 的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的 回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可 接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而 评价实验室操作时，常描述为实验室能力验证（ Proficiency testing, PT）。在以前的文献中，EQA 常描述室间质量控制。定 义n批 (Run) 在相同条件下所获得的一组 测定。 n均值（Mean） n标准差（Standard deviation, SD或s )n变异系数（Coefficient of variatio
3、n, CV ） 定 义n正态分布(Gaussian distribution) 当 一质控物用同一方法在不同的时间重 复多次测定，当测定数据足够多时， 如以横轴表示测定值，纵轴表示在大 量测定中相应测定值的个数，则可得 到一个两头低，中间高，中为所有测 定值的均值，左右对称的“钟形”曲线 ，亦即正态分布，又称高斯分布。 定 义n正态分布的基本统计学含义可用均数（） 、标准差（s）和概率来说明。临床实验室常规检验步骤n标本收集：选择测定项目、标本收集和保存 。n实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理 、检测、测定的有效性和临床诊疗价值。n报告和解释：结果发出、结果解释和临床管 理。质量保证、室内
4、质控和室间质评之间的关系实验室质量管理体系的建立n质量手册n质量体系程序文件n标准操作程序(相关记录表格)质量管理的内涵n写你所做的n做你所写的n记录你已做的n分析你已做的怎样编写SOP？分析你已做的n每次实验结果的分析表象与真象n多次实验结果的综合分析趋势的内在含义n仪器设备的使用情况分析维护与校准周期的有效性临床免疫检验方法n三大“标记”免疫检验技术:荧光标记、放 射性核素标记和酶标n其它标记免疫测定技术：发光物标记、金 标、元素标记等n免疫沉淀和免疫凝集试验免疫检验技术的应用(1)免疫比浊和免疫沉淀:灵敏度低;可用于体 内含量较高的Ig、补体、CRP等的测定;(2)标记免疫检验技术:放免
5、酶免灵敏度高;用 于含量低的激素、病原体抗原抗体测定等; 荧光标记技术有特定的应用;金标则为一种 很方便的point of care检验技术。免疫检验的标本n标本采集、运送和保存n可能影响测定结果的标本因素标本类型及采集容器n最常用的标本：血液，包括血清、 血浆和全血。唾液或尿液 。n建议采用真空采血管及蝶形针具， 以免直接接触血液。采集容器最好 为一次性无菌密闭容器。标本采集时间及患者准备n激素和治疗药物：可的松峰值在早晨46 点之间；生长激素、促黄体激素（LH）和 促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放， 须在密切相连的时间间隔内采取数份血样 本，以其中间值为测定值。又如当从卧位 变为站立
6、位时，血清中肾素活性将出现明 显增高。再如治疗药物的检测，应根据药 代动力学选择服药后的最适时间抽血检测 。 标本采集时间及患者准备n感染性病原体抗原、抗体n肿瘤标志物n特定蛋白可能影响测定结果的标本因素n内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异 嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌 酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等n外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本 贮存时间过长、凝固不全、反复冻融类风湿因子(RF)干扰nRF一般为IgM型，亦有IgG和IgA型nRF具有与变性IgG产生非特异结合的特点n在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为 明显，因为此时固相包被的抗体为抗人链 抗体，IgM型RF的存在
7、可使其大量结合于 固相。 类风湿因子干扰的排除n稀释标本n改变酶标抗体n用变性IgG预先封闭标本中RFn测抗原,可加入还原剂如2-巯基乙醇去除RFn使用特异的鸡抗体IgY作为酶标或固相抗体补体干扰n固相抗体和酶标二抗可因为其在固相吸附及结合过程中，抗体分子发生变构，从而其Fc段的补体C1q结合位点被暴露出来，这样C1q就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。n固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阴性结果或使定量测定结果偏低。 补体干扰的排除n56 30min加热可使标本中补 体C1q灭活n使用特异的鸡抗体IgY作为酶标 或固相抗体异嗜性抗体的干扰天然
8、的异嗜性抗体（IgG）可分为两类:n一类（85%的假阳性由其引起）可结合于山羊、小 鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的 Fab区结合。n另一类（15%的假阳性由其引起）可结合于小鼠、 马、牛和兔IgG的FC区表位，但不与山羊和大鼠 IgG的FC区表位结合。异嗜性抗体可通过交联固相 和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。异嗜性抗体干扰的排除n使用特异的兔F(ab)2片段作为固相或酶标抗体。n在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭 可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不 同时无效。n使用靶特异的非Ig亲和蛋白（Affibody）替代固相 或酶标抗体之一。采用噬菌体展示技术
9、展示来自 单个金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）联合文库的 人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜 性抗体的影响。n使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体。抗鼠Ig 抗体的干扰及排除n抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的酶免疫测定 ，可产生假阳性结果干扰排除可采用下述方法:n使用特异的抗体F(ab)2片段作为固相或测定酶标抗 体。n在标本或标本稀释液中加入过量的鼠Ig，封闭可 能存在的抗鼠抗体。n使用特异的鸡抗体IgG作为固相和测定抗体。鸡 IgG不与人抗鼠抗体反应。因而，用其作为固相或 酶标抗体不会出现假阳性结果。 自身抗体干扰n自身抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等 ，能与其相应靶抗原结合形成
10、复合物，在 ELISA方法中可干扰相应抗原抗体的测定。n为避免以上情况出现，可在测定前用理化 方法将其解离 溶菌酶干扰n溶菌酶可与等电点较低的蛋白有强的结合能力。 免疫球蛋白等电点约为5，因此，在双抗体夹心法 ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶标的 IgG间形成桥接，从而导致假阳性。n为保证ELISA测定的可靠性，有必要从标本中去 除溶菌酶或将其封闭，Cu2+离子和卵白蛋白可有 效地封闭溶菌酶，防止其联接IgG。标本溶血 n注意避免出现严重溶血。n血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过 氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶 的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓 度较高，则其就很
11、容易在温育过程中吸附 于固相，从而与后面加入的HRP底物反应 显色。标本被细菌污染n细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对 抗原抗体等蛋白产生分解作用n细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶 本身会对用相应酶作标记的测定方法产生 非特异性干扰。 标本贮存时间过长 n标本在28下保存时间过长，IgG可聚合 成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本 底过深、甚至造成假阳性。n血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2 8下保存一周，如为有菌操作，则建议 冰冻保存。样本的长时间保存，应在 70以下。 标本凝固不全 n血液采集后，如收集管中无促凝剂和抗凝剂，则 血液通常在半小时后开始凝固，1824h完全凝
12、固 。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心 分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的“血 清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白 原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍 可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性 结果n血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清 ，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管 中加入适当的促凝剂。冰冻保存标本避免反复冻融n反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中 的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假 阴性结果。酶联免疫吸附试验（ELISA）影响ELISA测定的因素n试剂盒的因素n实验操作影响ELISA试剂盒质量的因素n固相材料:聚苯乙烯塑料n抗原:纯
13、化、合成和基因工程抗原n抗体：多抗、单抗和基因工程抗体n酶结合物：酶免疫测定的核心成份n色原底物：OPD和TMBn运输贮存固相上抗原抗体的相互作用n固相上抗原抗体结合反应所需要的时间 n反应体积 n离解速率n微孔内特异抗体的免疫测定 n固相的抗体或抗原 EEE固相上抗原抗体结合反应 所需要的时间n固相抗原抗体结合达到平衡所需要的时间，要大 于液相免疫测定，并随液体所占体积与界面抗体 或抗原受体所占体积比的增加而增加。 n扩散性越强则反应所需时间越短，结合越充分。 这一点可通过旋转振荡来达到 ,也可在微孔中放一 个惰性的塞子以使反应液体成为一个小体积，或 使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纤维
14、素 ，或使用微颗粒来做到这一点。 反应体积n此处的反应体积并非是微孔中的液体体积，而是 固相免疫测定中与固相包被的抗体或抗原有接触 的部分 n固相抗原抗体反应发生于液体-固相界面，可能处 于一级结合键的引力距离内，小于100。液相中 待测抗原或抗体要进入到这个结合界面，需要扩 散或质量转移。n微颗粒的反应表面区域较微孔要大得多，因而处 于抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例 亦高得多。因此，结合反应的效率更高。这也是 全自动化免疫测定分析仪均采用微颗粒固相的重 要原因之一。 离解速率 n固相界面上结合反应的离解速率较液相中的要低两个梯度 n被动吸附于固相的抗原和抗体显然也是成簇或聚集状的，
15、 因此，反应界面的抗原或抗体可能也是“成簇的” n大多数抗原-抗体的离解所需的能量比防止其结合所需的 能量要大，表明在初始结合键形成后，又形成了次级结合 键。 n很高的固相抗体或抗原浓度，尤其是以成簇出现的以及来 自于限定的界面反应体积的抗体或抗原，使得离解的抗原 的重新结合较液相系统更为快速。n即使是测定的反复洗涤步骤，也可使抗原抗体仍保持处于 结合状态。 微孔内特异抗体的免疫测定 n使用吸附的复杂抗原进行微孔内特异抗体的免疫 测定，与液相测定相比，有明显的亲和力依赖性 n固相抗原的捕获能力差的原因:1.有结合能力的抗原浓度极低。这可能是由于所 吸附的抗原因为变性或空间位阻而致抗原表位丧 失
16、的结果。 2.抗原表位由于吸附发生改变，使得其被其抗体 结合部位以较低的亲和力结合。 固相的抗体或抗原 n固相化的抗体或抗原可能与液相中的抗体 或抗原所展示的构型差异酶免疫测定操作中的注意事项n试剂准备n加样n温育n洗板n显色n比色n结果判断n结果报告及解释试剂准备n从冰箱中取出的试剂，待温度与室温 平衡后使用；n所用蒸馏水或去离子水应保证质量。加 样n加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可溅出和 产生气泡。n从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。n全自动加样系统的标本“交叉污染”问题 温 育n常采用的温育温度有43、37、室温和4等。n 温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短。n温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面）或湿盒中，以使 反应溶液的温度迅速与室温平衡。 n“边缘效应”的排
