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1、临床免疫学检验免疫学检验的常用技术免疫学检验的常用技术 免疫比浊技术 生物素与链酶亲和素的应用技术 金标记酶免分析技术 免疫电泳技术 抗体提取纯化技术 放射免疫分析技术 免疫荧光测定技术 酶联免疫吸附试验 化学发光免疫分析技术 免疫印迹技术 流式细胞术金标记酶免分析技术 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，利 用硝酸纤维素（NC）膜等为固相载体，使金 标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进 行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标 记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风 湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。金标记酶免分析技术 原理：将滤金酸（HAuCl4）用还原法制成一定 直径的金溶
2、胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡 萄球菌A蛋白（SPA）或抗体，用于免疫印迹 、免疫渗滤、免疫层析试验。 金标记免疫层析是利用NC膜条状纤维的 毛细管作用，是样品在泳动中与金标记物及包 被在NC膜上的抗原或抗体结合，出现呈色的 阳性信号。酶免疫技术 酶和酶作用的底物： 1.辣根过氧化物酶（HRP）,常用底物为 邻苯二胺(OPD)，四甲基联苯胺(TMB)和 ABTS。 2.碱性磷酸酶(AP)，多采用对硝基苯磷 酸酯为底物。 3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、-半乳糖 苷酶和脲酶等。酶联免疫吸附试验 原理：酶联免疫吸附技术是免疫酶技 术中固相酶免疫测定的一种技术。基本 原理是将待测抗原或抗体先固定于固相
3、 载体表面，再用酶标记的抗原或抗体与 已被固定的相应抗体或抗原发生特异性 反应，加入酶底物及色原后呈色，呈色 程度用吸光度（A）值表示，所测A值与 待测抗体或抗原的水平呈相关关系。酶联免疫吸附试验 1.间接法：用于检测样本中特异性抗体 将已知特异性抗原包被于聚苯乙烯板微孔，形 成固相抗原；洗弃未结合的抗原；加待检样本 ，若其中含有特异性抗体则与固相抗原结合形 成抗原-抗体复合物；洗弃未反应的部分，加酶 标记抗抗体（一般为标记抗人IgG或葡萄球菌A 蛋白），使在固相载体上形成抗原-待检抗体- 标记抗体复合物；洗弃未反应的部分，加入酶 底物及色原呈色，在一定波长下测吸光度（A ）值判定待测抗体的有
4、无和水平。酶联免疫吸附试验 2.竞争法：用于检测待检样本中未知抗原或抗体 。 测定抗原（抗体）时用已知抗体（抗原）包被固 相载体，然后同步加入含有待测抗原（抗体）的 样本和酶标记抗原（抗体），使待测抗原（抗体 ）与酶标记抗原（抗体）竞争结合在固相载体上 的抗体（抗原）；洗板；加酶底物及色原呈色。 待测溶液抗原（抗体）量越多，则被结合的酶标 记抗原（抗体）量越少，呈色越浅。呈色深浅与 待测抗原（抗体）的量成反比。酶联免疫吸附试验 3.双抗体或双抗原夹心法： 双抗体夹心法：用于检测相对分子质量较大的蛋白质抗原 先将已知特异性抗体包被于固相载体上，加待测样本，若其 中有相应的抗原则与固相抗体特异性结
5、合；洗板后加入酶标 记特异性抗体，使在固相载体上形成包被抗体-待测抗原-酶 标记抗体复合物；洗板；加酶底物及色原呈色。抗原或抗体 水平与所测吸光度（A）值呈正相关。 双抗原夹心法：用包被抗原和酶标记抗原检测样本中的特异 性抗体。酶联免疫吸附试验 4.捕获法 5.生物素与亲和素ELISA(ABC-ELISA)酶联免疫吸附试验试剂组成 1.标记用酶 ： 最常用辣根过氧化物酶（ HRP）标记各种抗体、抗原或亲和素 2.酶底物与色原 ： HRP的底物是H2O2 （或过氧化脲）；HRP可用的色原很多 ，常用的为邻苯二胺（OPD），3，3， ，5，5，-四甲基联苯硫酸盐（TMBS） 等。传染病的免疫学检查
6、 1.甲型病毒性肝炎（HAV） 2.乙型病毒性肝炎(HBV) 3.丙型病毒性肝炎(HCV) 4.抗人类免疫缺陷病毒（HIV） 5.梅毒血清学检测（TP） 6.丁型肝炎(HDV)甲型病毒性肝炎（HAV） HAV属小RNA病毒，为正单链RNA病毒 。HAV主要经粪-口途径传播。潜伏期平 均28天。 HAV抵抗力较强，60加热10-12h后仍 具有感染性，85 加热立即灭活，对乙 醚、氯仿及PH为3的酸性环境有抵抗力 。甲型病毒性肝炎（HAV） 诊断甲型肝炎的特异性血清学指标是抗 HAV的IgM类抗体和IgG类抗体。人感染 HAV后，血液中首先出现抗HAV- IgM,与 发病后23周达高峰，因此抗H
7、AV- IgM 是公认的早期诊断甲型肝炎的指标。抗 HAV- IgG一般在急性感染后6个月达高 峰，然后逐渐下降，但维持时间较长， 可终身存在。因此抗HAV- IgG可作为人 群HAV既往感染的检测指标。乙型病毒性肝炎 生物学性状：HBV属于嗜肝DNA病毒科 。为双链环状DNA。完整的HBV病毒称 为Dane颗粒，球形，有包膜(即HBSAg) 。 HBV有三种颗粒：大球形颗粒，具有感 染性的完整颗粒，又称Dane颗粒；小球 形颗粒，无传染性；管形颗粒，不含病 毒核酸由小球形颗粒串联而成。乙型病毒性肝炎 HBV抗原包括： 表面抗原（HBSAg），是HBV的衣壳蛋白，是 HBV感染的主要标志，具有
8、抗原性，可刺激机体 产生抗HBS。抗HBS可中和HBV，是一种保护性 抗体。 核心抗原（HBCAg），是病毒的核衣壳成分， 被HBSAg包被，因此在感染者血中不易检出。 HBCAg可刺激机体产生抗HBC抗体。 e抗原（HBeAg），是HBV核心的可溶性抗原， HBeAg阳性表示病毒在体内复制，传染性较强。 HBeAg可刺激机体产生抗HBe 抗体，此抗体对 HBV感染具有保护作用。乙型病毒性肝炎 HBV对低温、干燥、紫外线、70%乙醇均有耐 受性。煮沸10010min、高压蒸汽灭菌121 15min或干热160 2h均可灭活HBV。 510g/L次氯酸钠30min，0.5%过氧乙酸 15min均
9、可破坏其传染性。 急性和慢性乙型肝炎病人及血液HBSAg阳性无 症状的携带者是HBV的主要传染源。可经血液 、唾液、精液和阴道分泌物等传播。HBV主要 经血液、血制品、性接触、日常生活接触和母 婴垂直传播。乙型病毒性肝炎目前检测的HBV特意血清标志物主要有 HBSAg、HBSAb、HBeAg、HBeAb、 抗HBC-IgM和抗HBC-IgG，常用检测方 法为ELISA法，金标记免疫层析法和化 学发光法。乙型病毒性肝炎测定原理1.HBSAg测定原理：采用双抗体夹心法。将纯化 的抗HBS包被固相载体，加入待测样品，若其 中含有HBSAg,则与载体上的抗HBS结合，再 加入HRP标记的抗HBS抗体，
10、加酶底物及色原 呈色.呈色程度与HBSAg含量成正比。 2.HBSAb测定原理：采用双抗原夹心法。 3.HBeAg测定原理：双抗体夹心法 4.HBeAb、 HBCAb测定原理：竞争法HBV血清学标志物的临床意义感染 模式HBSA gHBeAg抗HBC抗 HBe抗 HBS临床意义IgMIgG1+-急性乙肝潜伏期后期、携带者2+-急性乙肝早期或潜伏期3+-急性乙肝早期4+-急性乙肝后期5+-急性或慢性乙肝、有HBV复制6+-急性或慢性乙肝、7+-+-急性期或无症状携带者、HBeAg阴性慢性乙肝8+-+-慢性乙肝，无或低度HBV复制、乙肝恢复期 、 9-+-+既往感染、隐匿性慢性乙肝10-+接种过乙
11、肝疫苗丙型病毒性肝炎(HCV) HCV是单正链RNA病毒，呈球形颗粒状，主要 在干细胞内进行复制。 HCV对氯仿、乙醚等有机溶剂敏感，煮沸、紫 外线照射及甲醛处理均可使其灭活。 HCV主要经血和血制品传播。急性和慢性丙型 肝炎病人及HCV无症状携带者为HCV的主要传 染源。而ALT不正常者，为主要传染源。 HCV感染的特异性血清学标志是抗HCV抗体， 常用方法为ELISA,此为筛查方法。所测主要为 抗HCV-IgG。重组免疫印迹试验（RIBA）为 确诊试验。丙型病毒性肝炎检测原理 为间接ELISA法。包被抗原为HCV的基 因工程抗原和人工合成多肽抗原的最佳 比例组合物（含HCV的核心蛋白、NS
12、3 、NS4和NS5蛋白）。待测血清中如有 抗HCV，将与包被抗原结合，待加入酶 结合物（HRP-抗人IgG）和酶底物及色 原溶液后即可产生呈色反应。丙型病毒性肝炎(HCV)临床意义 HCV是输血后肝炎和散发性非甲非乙型 肝炎的主要病原。HCV感染后可导致慢 性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等多种肝脏 疾病。抗HCV阳性而血清中没有HCV RNA提示既往感染。抗人类免疫缺陷病毒（HIV） HIV属于逆转录病毒科慢病毒属，分两型，引 起全球艾滋病流行的为HIV-1型，流行局限于 西部非洲的艾滋病病原为HIV-2型。 HIV主要结构蛋白的基因至少有3个：gag基因 ，编码病毒衣壳蛋白p24;pol基因，编
13、码逆转录 酶(p66)与整合酶(p31);env基因，编码包膜糖 蛋白前体gp160,在蛋白酶作用下gp160裂解成 gp120和gp41。艾滋病临床分期 1.急性感染期 2.无症状感染期(潜伏期) 3.艾滋病相关综合征 4.艾滋病HIV传播途径 1.血液传播 2.性接触传播 3.母婴垂直传播HIV的抵抗力 HIV对酸性环境、消毒剂和去垢剂等敏感 ，病毒在PH2环境下失活，50%70%乙 醇、2%甲醛、5%石碳酸、0.1%戊二醛 、5g/L次氯酸钠等均可灭活HIV。 但该病毒对碱性环境（PH9.0左右），紫 外线较为耐受。抗人类免疫缺陷病毒（HIV） HIV实验室分为初筛实验室和确认实验室 。
14、 HIV初筛方法常用：ELISA、免疫荧光法 、胶乳颗粒凝集法、金标记免疫渗滤法 等 HIV确认试验：免疫印迹法（WB）ELISA法检测HIV抗体 原理： 采用间接ELISA或双抗原夹心ELISA法。用基 因工程或人工合成的HIV-1和HIV-2多肽抗原合 理地组合包被反应板微孔，若待测血清中存在 HIV抗体时，则与固相抗原结合，洗去未反应 物，再加酶标记的抗人IgG（双抗原夹心法采 用的是酶标记HIV多肽抗原组合）是酶底物及 色原显色。呈色程度与待测HIV抗体水平成正 比。ELISA法检测HIV抗体 试剂：筛查试剂必须是经国家食品药品监督管 理局注册批准、批检合格，临床评估质量优良 ，在有效
15、期内的试剂。 结果判定：按试剂盒内临界值计算公式计算， 高于临界值为阳性。 初筛阳性反应的标本需用原有试剂加上另外一 种不同原理不同厂家的试剂复测。如两种试剂 均为阴性，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性 反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室确 认。再经确认实验室确认前，初筛实验室不得发 布HIV阳性报告。可出具“HIV抗体待复检”报告 。ELISA法检测HIV抗体临床意义 HIV抗体阳性提示如下： 1.感染了HIV，可作为传染源将HIV传播他人。 2.抗HIV阳性者（除外18个月的婴儿），5年之 内将有10%30%的人发展为艾滋病。 3.对HIV抗体阳性的母亲所生的婴儿，如18个 月内检测HIV抗体阳性，不能诊断为HIV抗体感 染，尚需用HIV核酸检测或18个月后的血清抗 体检测来判断。 HIV抗体不确定提示：建议病人在报告后3个月 后重新复查，如复查阴性，则未被感染。如复 查阳性可判断感染HIV。免疫印迹法测定HIV抗体 结果判定： HIV抗体阳性有下列任何一项阳性即可确认： 1.至少有两条env带（gp41、gp160和gp120） 出现。 2.至少有一条env带和p24同时出现。 HIV抗体阴性：无HIV抗体特异带出现 HIV抗体不确定：出现HIV抗体特异带，但不足 以判定阳性。免疫印迹法测定HIV抗体 抗原检测：P24抗原 抗体检测：P24和P55的抗体出现最
