血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳

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1、血清蛋白质聚丙 烯酰胺凝胶圆盘 电泳第六组 蛋白质的分离v蛋白质是生物大分子化合物，具有胶 体性质、沉淀、变性和凝固等特点 蛋白质分离纯化的方法主要有：盐析 、透析、超离心、电泳、离子交换层 析、分子筛层析等方法。透析超速离心凝胶过滤层析离子交换层析电泳技术的原理v电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷，成为带电颗粒 ，在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量 和电荷量不同，其在电场中的泳动速率也不同，从而将蛋 白质分离成泳动速率快慢不等的条带。v电荷的来源蛋白质带有可解离的氨基（-NH2）和羧基(-COOH),是典型 的两性电解质，在一定PH条件下会解离带上电荷COO- COO- C

2、OOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PH蛋白质阴离子甘氨酸阴离子垂直板电泳的优点：v表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条 带更清晰。v可多个样品的电泳v胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高 。v胶版薄而透明，可制成干板，便于长期保存与扫 描。v可进行双向电泳。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电 泳中，只可以分离出56条区带，而在聚丙烯酰胺 凝胶电泳中可分离出数十条区带。v实验器材与试剂v器材 圆盘电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染缸、微量加样器、注射器、小烧杯v试剂（缓冲液PH值准确配置后用PH计调试）试剂编 号试

3、剂名称配置 14*分离胶缓冲液1mol/L盐酸24.0mL/100mL, Tris 18.2g/100mL (pH 8.9) 230%单体交联剂丙烯酰胺30.0g与甲叉双丙烯酰胺0.8g 100mL 3催化剂10%过硫酸铵 （临用前配置） 4加速剂TEMED 1mL加蒸馏水到10mL54*浓缩胶缓冲剂mol/L 盐酸48mL/100mL, Tris 5.98g/100mL (pH6.7) 610*电极缓冲剂甘氨酸28.8g与Tris 6.0g 加蒸馏水至100mL 稀释(pH 8.3)临用 前十倍稀释 72*上样缓冲剂溴酚蓝0.05g 20mL甘油，加5号试剂25mL，定溶至100mL 8固定

4、液三氯乙酸12.50g 加蒸馏水至100mL 9考马斯亮蓝R250染色液1.25g考马斯亮蓝R250,溶于227mL甲醇中加蒸馏水227mL冰 醋酸46mL10脱色液甲醇:冰醋酸:水按3:1:6比例配合v实验操作v凝胶柱的准备（凝胶溶液配制表见教材表4-4）取玻璃管， 一段封口加入分离胶 溶液(7cm)加入蒸馏 水制备分离胶 应迅速为了使表面平 整，与空气隔 绝静置待凝胶 聚合浓缩胶制备 (1cm)吸取上表面蒸 馏水待凝胶与水面的 界面重新可辨切勿触 动胶面参见分离 胶加入分离胶 溶液(7cm)制备分离胶 应迅速加入分离胶 溶液(7cm)制备分离胶 应迅速加入分离胶 溶液(7cm)制备分离胶

5、应迅速加入分离胶 溶液(7cm)制备分离胶 应迅速加入蒸馏 水为了使表面平 整，与空气隔 绝 取玻璃管， 一段封口加入分离胶 溶液(7cm)制备分离胶 应迅速取玻璃管， 一段封口加入分离胶 溶液(7cm)制备分离胶 应迅速取玻璃管， 一段封口加入蒸馏 水为了使表面平 整，与空气隔 绝 加入分离胶 溶液(7cm)制备分离胶 应迅速取玻璃管， 一段封口v装柱将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽 ，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入 为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜)v加样取血清12L ，7号试剂12L混匀，品均加入4管，每管6L.（加样 枪不可插

6、入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液 引起样品扩散。）v电泳接通电源，上负下正，先调节电流1mA/管，待示踪染料进入分离胶后 调节为23 mA/管，待示踪染料离管下口0.5cm时切断电源。v剥胶注入蒸馏水做润滑剂，针头螺旋式前进，缓缓剥离。v固定、染色及漂洗将凝胶柱浸入8号剂中泡10min，进行固定，用9号剂染色10min，用清 水冲洗，放入10号剂中漂洗脱色。v结果示意图 2 1注意事项：v丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用， 注意避免直接接触v丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测pH值 是否失效。失效液不能聚合。v加速剂（TEMED）要密封保存，过硫酸溶液现配现用，防止氧化 失效。v配好胶后应尽快灌胶（不要形成气泡）v切记装柱后应用蒸馏水密封v灌胶和电泳时要注意排气泡v加样时不能损伤凝胶表面v电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直v固体胶切忌倒入水池The end!谢谢！