08_现代分子诊断技术

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1、第八章第八章 现代分子诊断技术现代分子诊断技术酶联免疫吸附测定DNA诊断系统DNA指纹随即扩增多肽DNA遗传性疾病的分子诊断癌症的分子诊断有效诊断应该具备的条件 专一性强。即诊断只对目标分子或某一病原菌产生阳性反应； 灵敏度高。是指即使只有微量的目标分子，或是在有很多干扰物质存在的情况下，也能够有效诊断； 操作简单。便于进行大规模检测。传统诊断技术传统诊断技术一般包括两个过程： 先对病原物质进行培养，培养后分析它的生理 学特性 再分析鉴定它是那一类的病原物，是细菌、病 毒，还是其他物质特点: 方法具有有效性，但也具有明显的缺陷，如诊断的成本高、速度慢、效率低；对于无法 人工培养的病原物质以及尚

2、未鉴定的病原物，临 床诊断非常困难。砂眼衣原体（Chlamydia trachomatis）一种专性寄生于细胞内的衣原体，进行体外培养的时间特别长，而且假阳性特别多，无法及时给予 明确诊断朊病毒（Prion）专性活细胞寄生物，无法体外培养，传统的病原微生物培养方法根本无能为力。现代分子诊断技术现代分子诊断技术主要是指是应用免疫学和分子 生物学对病原物质进行诊断检测.v是多学科综合的产物,它涉及到微量化学,多种分 离技术,检测系统,微电子技术,信息技术等多种技 术.v可应用与多个领域,包括法医鉴定、民事鉴定、 各种理论或应用生物医学研究,环境检测、毒理学、生物除污、农业及畜牧业管理等。7.1 酶

3、联免疫吸附检测 Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)vELISA的工作原理: 抗体与抗原分子之间的特异性识别反应vELISA通常的检测过程包括以下几个步骤:1) 将待测样品结合在固体支持物上 常用的支持物市带有 96孔的微量滴定板(microtiter plate);2) 加入可以与目标分子特异反应的抗体 即一抗(Primary antibody)，反应后进行冲洗，将未结合的一抗洗去;3) 加入二抗(Secondary antibody) 二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子。二抗上还联着一种酶， 这些酶能够催化一种化学反应将无色底物转变为有

4、色 物质。一抗与二抗反应完后，再次冲洗将未与一抗结 合的二抗洗去4) 加入无色底物 如果样品中带有目标分子，一抗能够与之特异性结合，二抗可以与一抗结合，二抗上联带地 酶就可以将无色地底物转变未有色物质可以判断出样 品中带有目标分子了固体支持物一抗酶联二抗发光底物ELISA 吸附试验的其他方法间接法：用于测定抗体。 用抗原耦联固相载体，然后加入含有特异抗体的血清，孵育一定时间后，固相载体表面的抗原和 抗体形成复合物。洗涤去其他成分，再加上酶标记 的抗球蛋白结合物，加入底物，在酶的作用下产生 有色物质。夹心法：用于测定大分子抗原。将纯化的特异性抗体耦联于固体载体，加入含待测抗原的溶液孵育后，洗涤除

5、去多余的抗原 ，再加入酶标记的特异性抗体，使之与固相载体 表面的抗原结合，再洗涤除去多余的酶抗体结合 物，最后加入酶的底物。竞争法：用于测定小分子的抗原和抗体将特异性的抗体耦联固体载体，加入待测抗原的溶液和一定量酶标记抗原共同孵育，对照仅 加酶标抗原，洗涤后加入酶底物。被结合的酶标 记抗原的量由酶催化底物反应产生的有色物质的 量来确定。ELISA 抗体v由于技术限制，ELISA所用的抗体并不能都专一地结 合待测抗原。 因此，ELISA检测方法具有一定的局限性。可能出现错诊或误诊的情况。很多病原菌，尤 其是对于病毒类的感染，仅凭ELISA难以得出确定的结论。v要对某一目标分子进行诊断检查，最好采

6、用单克隆抗 体。当病原分子与非病原分子之间只差一个抗原决定 簇时，如果采用多克隆抗体，那么在ELISA中都会发生颜色变化，导致无法区分病原物质。表7-27.2 DNA诊断系统原理：任何一个决定生物学特性的DNA序列都应 该是独特的，都可以用作专一性的诊断标志。方法：核酸杂交、PCR检测Southern-blotting7.1 核酸杂交v核酸杂交的检测过程主要步骤： 1) 将单链目的DNA结合于膜上（硝酸纤维素膜或 者尼龙膜）； 2) 加入已标记的单链探针，在一定的温度和离子 强度下使探针分子与目标DNA分子碱基配对；3) 冲洗。洗去未结合的标记探针DNA；4) 检测探针和目标DNA形成的杂合分

7、子。v核酸杂交诊断检测 的关键要素：探针DNA，目的DNA和信号检测 杂交探针v杂交探针DNA：高度特异性的DNA片段，只与特定目标DNA序列杂交。杂交探针可以用来区分两个或多个物种 （种级探针），也可以用来区分某一物种内的某 些特定的株系（亚种级探针），甚至可以用来区 分基因间的差异。杂交探针可以是DNA，也可以 是RNA，可以是克隆的完整基因，也可以是基因的一个片段。杂交探针的制备杂交探针的制备（1）通过构建基因文库制备杂交探针 先提取某一病原微生物株系的染色体DNA，然后用一限制性内切酶进行酶解，将得到的酶解片段与质粒载体连接，构成质粒文 库。文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原微

8、生物和非病 原性微生物的核酸DNA进行杂交，筛选；如果重组质粒的插入片段只与病原微生物有杂交信号，那么这个插入片段就可能是一个种特 异的探针，要确定这个探针是不是只与病原菌株杂交，还要进一步鉴定。（2）从已知基因片断通过酶切制备探针；（3）从已知基因组序列通过PCR扩增制备探针；（4）从mRNA序列逆转录制备探针；（5）直接化学合成制备探针 v核酸杂交具有很高的灵敏度和可靠性可以用探针直接与样品中的目标DNA进行杂交 ，无需预先纯化DNA；如果样品中的目标分子非常少，那可以先通过PCR 将目的序列扩增在进行杂交检测。v目前已分离出100多种不同的DNA诊断探针，用来 鉴定各种病原细菌、病毒和寄

9、生虫的致病株。核酸探针的标记v同位素标记的杂交探针： 同位素标记中使用的最 多的是32P，其放射性强度越高，结果越好。标记 好的探针与目的DNA杂交后，再洗去未杂交上的 探针DNA，经过一定的曝光时间，杂交结果将在X 光片上显示出来（放射自显影）v32P的缺点：半衰期短（只有13天）；操作起来比较危险；必需要有特殊的实验室设备进行操作； 放射性垃圾处理很繁琐。v非同位素标记的杂交探针：大多数的非同位素检 测系统都采用生物素（biotin)标记的核苷酸掺入 DNA的方法制备探针。v非同位素标记探针的杂交过程： 将生物素标记的探针杂交到目的DNA分子上 加入抗生物素蛋白（avidin)或链霉抗生物

10、素蛋白 (streptavidin) 加入一种生物素标记的酶，比如碱性磷酸酶 根据不同的酶加入不同的生色或化学发光底物，然 后根据颜色变化或化学发光来检测杂交的结果。v生物素标记的探针检测原理抗生物素蛋白和链霉抗生素蛋白能与生物素紧密结合，而且每个抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白都有4个分别独立的生物素结合位点，因此每个抗生物素蛋白既能结合生物素标记的酶（酶的活性不会改变），也能结合生物素标记的探针；在生色反应中，酶在杂交DNA的位置上催化形成一个有色可溶的染料带，而化学发光反应则是在杂交DNA的位置上由酶催化形成的发光的产物带 。链霉抗生素蛋白生物素标记的 碱性磷酸酶发光底物目的目的DNADN

11、A化学发光化学发光检测示意图检测示意图非放射性检测系统的优点非放射性检测系统的优点 用生物素标记的DNA在室温下至少可以保存一年； 检测化学发光的仪器具有与同位素检测类似的灵敏度； 检测反应可以在几个小时内完成。探针的荧光标记探针的荧光标记如果目的DNA的量很少，解决办法是：（1）通过PCR扩增得到增加的目的DNA量；（2）使用荧光标记法进行直接检测或检测PCR产物 。荧光标记法：在探针的5末端进行荧光标记，标记的 DNA可以在吸收较短波长的光后，发出较长波长的荧光。常用的荧光标记物：荧光素（fluorescein）在特定波长下发生绿光；罗丹明（Rhodamine）在特定波长下发生红光。荧光检

12、测 优势：Southern分析已被应用于 多种DNA诊断系统的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因重排检测的 “金标准”。 局限：需要较大量（10 mg）新鲜或冰冻组织，操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长（约两周），易污染等缺 点，仅适用于科研而不适用于临床诊断。 改进：荧光素标记IgH、 Igk、Igl及各种TCR探针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素取代了同位素作为标记； 缩短了曝光时间(510分钟)，并且敏感性不降低，非常有利于在临床诊断中推广、应用。 DNA发生突变或重排后，其扩增产物条带与正常的有 差异，由此可以检测DNA重排 淋巴瘤诊断： 淋巴瘤是细胞克隆性增

13、生的结果，其特殊的基因重排形式占一定的数量优势，从而成为细 胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR（T细胞受体） 的V、D、J、C区基因编码中20 个左右的保守核苷酸序列，人工合成一对或多对（家族基因）引物，以待 测样品DNA为模板，扩增目的DNA序列片段。如果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带，而良性增 生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状，不形成单 带。7.2 常规PCR技术转基因材料外源基因的检测1,标准分子量；2，质粒；3，对照；4-8，转基因植株1 2 3 4 5 6 7 8 转基因黑麦草PCR检测外源Ubi启动子(1) PCR-RFLP: 多聚酶链反应(PCR)-限制性片段长

14、度 多态性 (restriction fragment length Polymorphism， RFLP) 原理：PCR产物限制性内切酶切多态性分析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。 优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析与比较,微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断等。 局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变筛选，检测效率低。PCR相关技术 PCR-RFLP原理示意原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单 链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙 烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与

15、标准物的对 比，即可检测出有无变异。刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过 放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA 带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特 点。1993年起用EB染色法显示DNA带型，使得SSCP 操作更简单，更经济，更迅速。（2）PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism)聚合酶链反应一单链构象多态性 （ PCR-SSCP）示意优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、 不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛应用 于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基 因的多态性

16、分析等。（3）PCR-southern blot及Dot blot技术：PCR-southern blot 原理：是将PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼 龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，来检测有无特定的扩 增片段及相对含量。 优点：可以直接检测基因的点突变，缺失及重排，比PCR 产物EB染色电泳分离法的灵敏度至少要高103以上，由于 非放射性同位素标记的探针的应用，使得PCR-southern blot应用更简便，现己广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病 原体特异基因等方面的研究及检测。PCR-Dot blot即是将PCR扩增产物变性后直接点在膜上，与标记的特异性探针进行杂交。 优点：时间短，可半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。 局限：只能看到一个斑点，必须小心控制反应条件，设立阳性及阴性对照，以便对检