《山东大学遗传试验报告,人类X染色质的制备和观察》由会员分享,可在线阅读,更多相关《山东大学遗传试验报告,人类X染色质的制备和观察(3页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、人类 X 染色质的制备和观察摘要本次实验,以人体口腔黏膜细胞、 发根毛囊细胞为实验材料, 通过硫瑾染色、 压片等方法观察到了巴氏小体在细胞核内的分布及形态等特征,掌握了鉴定人类 X染色质的方法,在显微镜下正确识别X 染色质,即 Barr 小体的形态特征及所 在部位,并了解 X染色体失活的有关假说以及为失活X染色体上的基因所控制的 遗传性状地特点。 在镜下观察中,来自女生的材料制片中可以清楚观察到巴氏小体,在男生的 实验材料中,虽然细胞核染色均匀,但不能观察到巴氏小体。引言X染色质(又称巴氏小体,性染色质小体,X小体)是由雌性哺乳动物体细 胞中失活的 X染色体在间期细胞核中呈异固缩状态(染色质高
2、度螺旋化) ,形成 直径约 1m ,贴近于核膜边缘的染色小体。巴氏小体在显微镜下为一结构致密 的浓染小体,一般靠近核膜处,约1-1.5 m大小。形状多样有卵圆形,三角形, 月牙形,线性等。正常女性口腔粘膜细胞中约30-50% 有一个巴氏小体,男性则 低于 1-2%。细胞分裂间期 X染色体在细胞核中出现异固缩现象:浓缩、染色深、 无活性;在细胞分裂期巴氏小体可形成正常的染色体形态;复制时间比有活性的 X染色体稍迟一些。在个体中,X染色质数目等于一个个体的X染色人体数减 1。1949年,加拿大学者 Barr 在雌性猫的神经元细胞核中发现一种染色很深的 小体,而在雄性猫中则极少出现。Barr 称这种
3、小体为核仁随体,现在我们通常 称为巴氏小体。1961年,Mary Lyon 提出了 X染色体失活的假说:1.雌性哺乳动物的两条X染色体中,只有一条 X染色体有转录活性, 另一条 X染色体无转录活性,呈固缩状,形成X染色质。2.失活发生在胚胎发育早期。3.失活是随机的。X染色体的随机失活是性别决定机制为XY的动物为平衡两性之间性染色体 上的基因剂量而采取的一种特殊的调控方式(因为Y染色体上的基因数量很少, 因此雌性个体必须通过减少X 染色体上基因剂量的方式使两性个体间基因剂量 取得均衡),即所谓的“剂量补偿”,这也是X染色体失活的意义所在。 人们对 X染色体失活的机制、 不同物种的剂量补偿方式及
4、机制等问题进行了 广泛、深入的讨论。据研究,X染色体的失活发生胚胎发育早期,在X染色体长 臂靠近着丝点的一段序列控制X染色体的失活, 称为 X染色体失活中心 (XIC), 将这段序列通过易位方式转移到常染色体,也能引起常染色体的失活。XIC 中含 有 一 个 转 录 后 不 翻 译 的RNA 基 因 : Xist基 因(X - inactive - specifictranscript),它的表达量与 X染色体的失活有关。 为了掌握鉴定人类X染色质的方法,在显微镜下正确识别X染色质,即 Barr 小体的形态特征及所在部位, 并了解 X染色体失活的有关假说, 本次实验以人体 口腔黏膜细胞、 发根
5、毛囊细胞为实验材料, 通过硫瑾染色、 压片等方法进行镜下 观察。实验材料及药品口腔上皮细胞发根细胞载玻片 盖玻片 牙签 1N 盐酸硫瑾 95%乙醇生 理盐水 显微镜实验步骤(1)取材用灭菌的牙签轻刮口腔上皮,(第一遍弃去,注意不要刮破上皮)涂 3-4 个玻片,晾干。(或刮取发根毛囊置于载玻片上,晾干)。 (2)加 1N的盐酸水解 10-15 分钟。轻轻水洗,晾干。 (3)硫瑾染色 15-20 分钟。 (4)压片。 (5)显微镜观察。巴氏小体靠近核膜边缘,染色较深,实际大小1-1.5 m ,放 大 400x 后大约 0.4-0.6mm。实验结果图片见后,在图片中存在大量染料,与巴士小体很难区分实
6、验结果影响因素细胞数目不够多,所取的口腔上皮细胞太少 细胞没有完全固定在载玻片上 染色液染色时间不够长或者过长 染色液中染料颗粒太多, 以至于显微镜下到处是染料颗粒,影响观察, 也影响区 分巴氏小体。 作业、思考题 1、绘制巴氏小体图片 2、掌握概念:巴氏小体、性染色质、X小体、剂量补偿效应 现在一般认为巴氏小体是存在于XY型性别决定的生物中,雌性动物的一条 X染色体在间期异染色质化形成深染的结构。这个小体叫巴氏小体, 又叫 X小体, 性染色质,这种小体与性别和X染色体的数量有关。 剂量补偿效应:在XY型性别决定的生物中,性连锁的基因表达在两性间有 相同或相近的剂量遗传效应, 也就是说, 在雌
7、雄动物的细胞中, 由 X染色体编码 的酶或其它蛋白等基因产物在数量和质量上相等或相近。 剂量补偿效应的补偿方式: 哺乳动物 X染色体随机失活或父源X染色体失活 有袋动物父源 X染色体失活 黑腹果蝇雄性个体 X染色体基因表达水平加倍 秀丽线虫雌性两条 X染色体基因表达水平减半 3、查阅相关文献指出巴氏小体研究的新进展 研究进展 在人类的 X染色体上有大约 1500 万个碱基对,涉及到几千个基因,究竟是如何 调节表达的呢?进入90 年代以来取得了许多重要的研究的结果。 (1)大多数 X连锁的基因在胚胎发育早期的过程中表现为稳定的失活,但是并 非整条 X染色体上的基因全部失活。如xist基因,他的表
8、达可以导致并维持它 所在的染色体失活。(2) X 染色体上存在一个特异的失活中心(XIC),证据是 X 染色体某一区域 的缺失可能导致 X染色体不失活,胚胎不能存活。 (3)在失活的 X染色体上,失活基因与有活性的基因是相间排列的。文献 Human inactive X chromosome is compacted through a polycomb-independent SMCHD1-HBiX1 pathway ChIP-seq (human) Obuse lab., Graduate School of Life Science, Hokkaido University Human
9、inactive X chromosome (Xi) forms a compact structure called the Barr body, which is enriched in repressive histone modifications such as trimethylation of histone H3 Lys9 (H3K9me3) and Lys27 (H3K27me3). These two histone marks are distributed in distinct domains, and XIST (X inactive specific transc
10、ript) preferentially colocalizes with H3K27me3 domains. Here, we show that Xi compaction requires HBiX1, a heterochromatin protein 1 (HP1) binding protein, and SMCHD1 (structural maintenance of chromosomes hinge domain containing 1), both of which are enriched throughout the Xi chromosome. HBiX1 loc
11、alization to H3K9me3 and XIST-associated H3K27me3 (XIST-H3K27me3) domains was mediated through interactions with HP1 and SMCHD1, respectively. Furthermore, HBiX1 was required for SMCHD1 localization to H3K9me3 domains. Depletion of HBiX1 or SMCHD1, but not Polycomb repressive complex 2 (PRC2), resul
12、ted in Xi decompaction, similarly to XIST depletion. Thus, the molecular network involving HBiX1 and SMCHD1 links the H3K9me3 and XIST-H3K27me3 domains to organize the compact Xi structure. 人类不活跃的 X染色体(Xi)形成的紧密结构称为巴氏小体,其含有大量抑 制性组蛋白修饰如H3组蛋白 H3K9me3 和 H3K27me3 的三甲基化。这两个组蛋白标 记分布在不同的结构域里,并且X染色体的异转录物优先地与
13、H3K27me3 结构域 共区域化。这里, 我们展示的是,Xi 紧密区需要 HBiX1, 一个异染色质蛋白1 (HP1 ) 结合蛋白 , 和 SMCHD1(染色体铰链区 1 结构维持蛋白) ,二者在 Xi 中大量存在。 HBiX1定位于 H3K9me3 ,与 XIST 相关联的 H3K27me3 结构域分别通过与HP1和 SMCHD1 反应而联系在一起。 而且, SMCHD1 定位到 H3K9me3 区域需要 HBiX1。 HBiX1 或 SMCHD1 消耗,不是 Polycomb 蛋白抑制性复合物2(PRC2 ),导致 Xi 的解压, 这和 XIST 消耗相似。所以,包括HBiX1和 SMCHD1 在内的分子网络连接H3K9me3 和 XIST-H3K27me3 区域形成了紧密的Xi 结构。