医疗器械微生物检验

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1、医疗器械微生物限度检验1概述n微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂 及其原料、辅料受微生物污染程度的方法 。 微生物限度检查细菌、真菌菌落数控制菌2概述n微生物：形体微小，结构简单，通常要用光学 显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物n特点： 1、个体微小，一般0.1mm2、构造简单，有单细胞的，简单多细胞 的，非细胞的3、进化地位低n分类：原核类：二菌，四体（细菌、放线菌、螺旋 体、支原体、立克次氏体、衣原体）真核类：真菌，原生动物，显微藻类非细胞类：病毒，亚病毒34概述n医疗用品的分类n按医疗用品与人体接触的性质以及对人体使用安 全性要求分三类：a) 类医疗用品：接触人体完整皮肤的医疗用品b)

2、 类医疗用品：接触人体未破损粘膜的医疗用 品c) 类医疗用品：进入人体无菌组织、器官和血 液 以及接触破损皮肤和粘膜的医 疗用品 5常用检测标准n中华人民共和国药典 2010年版二部附录XI J “微生物限度检查法”nGB 15979-2002 一次性卫生用品卫生标准 附录BnISO11737-1:2006 Sterilization of medical devices Microbiological methodsPart1: Determination of a population of microorganisms on products6项 目药典2010GB15979-2002细

3、菌定量：营养琼脂培养基 2个平皿定量：营养琼脂培养基 5个平皿真菌定量：玫瑰红钠琼 脂培养基 至少2个平皿 72h酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基定量：沙氏琼脂培养基 5个平皿 7天 定性：沙氏液体培养基 7天大肠 埃希菌 胆盐乳糖培养基 、MUG培养基 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 /大肠 菌群胆盐乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康 凯琼脂培养基 、乳糖发酵培养基乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵培 养基沙门菌 营养肉汤 、四硫酸钠亮绿培养基 、胆盐硫乳琼脂（ 或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙 红亚蓝琼 脂）培养基 、三糖铁琼脂培养基 /铜绿假 单胞菌胆盐乳糖

4、 、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 、氧化 酶试验 、绿脓菌素试验、 SCDLP培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培 养基 、氧化酶试验 、绿脓菌素试验、硝酸盐 还原产气试验、明胶液化试验42生长试验 金黄色 葡萄球菌 亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基 、卵黄 氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基 、血 浆凝固酶试验 SCDLP培养基、血琼脂培养基、甘露醇发酵 试验、血浆凝固酶试验梭菌 庖肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基 、 过氧化氢酶试验 /溶血性链 球菌/葡萄糖肉汤、血琼脂培养基、链球菌试验、杆 菌肽敏感试验 白色念珠 菌沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、念 珠菌显色

5、培养基、1%聚山黎脂80-玉米琼脂培养基、 芽管试验/ 7实验条件n无菌操作技术n实验环境n实验器材8无菌操作技术n微生物学基础n微生物实践基础n无菌操作意识9实验环境n洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流 空气区域或隔离系统；n定期按GB/T16292-16294：2010医药工业洁 净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试 方法的现行国家标准进行洁净度验证；n实验中监控：实验时将制备好的营养琼脂平板 打开放于实验台上，至实验结束收起，30 35培养48h，菌落平均数应小于 1cfu/90mm。 10实验器具n仪器超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸 汽灭菌器、薄膜过滤装置

6、、比浊仪等。n用具试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精 密PH试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服 、牛皮纸等。11实验准备n实验环境保证n实验试液n培养基n灭菌方法12实验环境保证n环境清洁，表面消毒（ 75%(V/V)乙醇、 新洁尔灭(1:1000)溶液或其他适宜消毒溶 液）n空气过滤系统，紫外灯或臭氧空气消毒仪13实验试液n稀释剂1.0.9%氯化钠溶液2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 3.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：调解pH至近中性，其中 蛋白胨对细菌细胞有保护作用有利于菌落数及控制菌测 定。n表面活性剂、中和剂或灭活剂n鉴定用试剂1.靛基质试液2.1

7、%二盐酸二甲基对苯二胺试液（氧化酶试液）3.三氯甲烷4.1mol/l盐酸试液 14培养基n标准菌株处理及增菌用培养基n选择性培养基n鉴别培养基15培养基n培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。应 按各种培养基要求准确测定调节pH值。多 数细菌生长的适宜pH值为7.27.6。酵母 菌霉菌（6.06.5）。调节可用1N HCl或 NaOH。n培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培 养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损 失培养基的必需营养成分。 n制成的培养基应透明，以便观察细菌生长 性状以及其他代谢活动所产生的变化。16灭菌方式n湿热：115 121 ，15min30min物品切勿立即取出置冷处，以免急

8、速冷却 ，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，以致 染菌。n干热：160 170 ，2h适于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭 菌。 n灭菌程序需要经过验证。17计数培养基适用性检查n细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行 培养基的适用性检查，成品培养基、由脱 水培养基或按处方配制的培养基均应检查 。18计数培养基适用性检查n菌种大肠埃希菌 CMCC（B）44 102金黄色葡萄球菌 CMCC（B） 26 003枯草芽孢杆菌 CMCC（B） 63 501白色念珠菌 CMCC(F) 98 001 黑曲霉 CMCC(F) 98 003 n验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从 菌种保存中心获得的冷冻干燥菌

9、种为第0代）， 并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株 的生物学特性。19计数培养基适用性检查n菌液制备 取细菌新鲜培养物（一般18h24h，白念 24h48h ，黑曲霉 57天 ），用0.9%无菌氯 化钠溶液制成每1ml 含菌数50cfu100cfu的菌 悬液 （黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无 菌氯化钠溶液）；n菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存 在2 8可以在24小时内使用。黑曲霉孢子 悬液可保存在2 8，在验证过的贮存期内 使用。20计数培养基适用性检查n培养基接种 金黄色葡萄球菌2个平皿营养琼脂培养基 大肠埃希菌2个平皿枯草芽孢杆菌2个平皿玫瑰红钠琼脂培养基 白

10、色念珠菌2个平皿黑典霉2个平皿酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基：白色念珠菌2个平皿 用相同的对照培养基替代被检培养基做对照21计数培养基适用性检查n结果判定若被检培养基上的菌落平均数不小于对照 培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形 态大小应与对照培养基上的菌落一致，判 该培养基的适用性检查符合规定。22样品准备n供试品进入无菌实验室前应作表面消毒， 用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻 底消毒。n检验数量：应从2个以上最小包装单位中 抽取供试品，膜剂还不得少于4片。n一般应随机抽取不少于检验用量（两个以 上最小包装单位）的3倍量供试品。23样品准备n检验量：除另有规定外，一般供试品的检 验量为1

11、0 g或10ml；化学膜剂100cm2； 贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌 减。要求检查沙门菌的供试品，其检验应 增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳 性对照试验）。24供试液制备n液体供试品、固体、半固体或黏稠液供试品 取10ml或10g用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml ，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌吐温80 使供试品分散均匀;水溶性液体亦可用混合供试品原液作为供试液；n非水溶性供试品 ：乳化或萃取;n膜剂供试品 ：取供试品100cm2，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液100ml浸泡，振摇，作为1：10的供试液;n肠溶及结肠

12、溶制剂供试品：取供试品10g ，加pH6.8无菌磷酸 盐缓冲液(用于肠溶制剂)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠 溶制剂）至100ml，置45水浴中，振摇，使溶解，作为1： 10的供试液;n气雾剂、喷雾剂供试品 ，经处理后同第一项制备供试液;n贴剂供试品n具抑菌活性的供试品 ：培养基稀释法 、离心沉淀法 、薄膜过 滤法 、中和法; 25细菌、霉菌及酵母菌计数 n实验方法倾注平皿法薄膜过滤法n培养基细菌总数：营养琼脂培养基 霉菌及酵母菌计数：玫瑰红钠琼脂培养基 、酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基 26细菌、霉菌及酵母菌计数n培养和计数除另有规定外，细菌培养3天，逐日点计菌落数霉菌、酵母菌培养5天，逐

13、日点计菌落数必要时可延长至7天进行菌落计数点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌 落数，按菌数报告规则报告菌数27细菌、霉菌及酵母菌计数n方法验证n（1）试验组 平皿法：供试液1ml +1ml 试验菌菌悬液，平行 制备2个平皿，菌落计数；薄膜过滤法：供试液，过滤，冲洗，在最后一 次的冲洗液中加入1ml试验菌，过滤，菌落计数 ；n（2）菌液组 测定所加的试验菌数；n（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落 计数方法测定供试品本底菌数；n（4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、 乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时， 应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程 中微生物受影响的程度。稀释剂+

14、试验菌菌悬液 ；28细菌、霉菌及酵母菌计数n验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分 别计算各试验菌每次试验的回收率。n结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数 回收率应均不低于70%；若试验组的菌数回收率均不低于70%，可照该 供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、 霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70% ，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过 滤法、中和 法等方法或联合使用这些方法消除 供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。29细菌、霉菌及酵母菌计数n1.平皿法采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续 23个稀释级的供试液。取供试液1ml，置直径90m

15、m的无菌平皿中，注 入1520ml 温度不超过45的溶化的营养琼脂 培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨 葡萄琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每 稀释级每种培养基至少制备2个平板。阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml，置无菌 平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种 计数的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长 。30细菌、霉菌及酵母菌计数营养琼脂-细菌 玫瑰红钠琼脂培养基-霉菌31细菌、霉菌及酵母菌计数n1.平皿法n菌数报告规则：细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300、霉菌 宜选取平均菌落数小于100的稀释级，作为菌数 报告（取两位有效数字）的依据；以最高平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1

16、g、 1ml或10cm2供试品中所含的菌数；如果各稀释级的平板均无菌落生长，或仅是最 低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。32细菌、霉菌及酵母菌计数n2. 薄膜过滤法n取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液， 加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品 每1g或1ml 所含的菌数较多时，可取适宜稀释 级的供试液1ml ，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋 白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲 洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基 或玫瑰红钠培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂 培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张 滤膜。n阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml，照上述 薄膜过滤法操