实验十 酵母核糖核酸的分离及组

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1、 实验十 酵母核糖核酸的提取 及RNA的含量测定(苔黑酚法 )实验目的:v 了解核酸的组分v掌握提取核酸和鉴定核酸组分的方法v掌握 苔黑酚法测定RNA含量的原理和 方法。实验原理:酵母中RNA含量较多, 含量可达2.67 10.0%,DNA很少(0.030.516),提取 RNA以酵母最为理想。RNA可溶于碱性溶液,研磨后离心去除 沉淀(细胞碎片),当碱被中和后,上清液 中加入乙醇可以使解聚的核糖核酸沉淀,离 心弃上清液,可得到RNA的粗制品。RNA versus DNA - Stability issues一、一、核酸的水解1. 碱水解lRNA的磷酯键易被碱水碱、DNA的磷酯键不易被碱水 解

2、。例如,在0.1 mol/L NaOH溶液中,RNA几乎可以 完全水解,生成2-或3-磷酸核苷;DNA在同样条件下 则不受影响。这种水解性能上的差别,与RNA核糖基 上2-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解 时,2-OH首先进攻磷酸基,在断开磷酯键的同时形 成环状磷酸二酯,再在碱的作用形成水解产物。一、一、核酸的水解2.酸水解核酸分子中的糖苷键和磷酸二酯键 在酸性条件下水解切断。其中糖苷键比 磷酸二酯键更容易遭到水解。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱 和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解, 从水解液中可以测出上述组分的存在。 (1)核糖 糠醛糠醛+甲基苯二酚(地衣酚、苔黑酚)鲜绿色的复

3、合物( 670nm )Fe3+H+(2)嘌呤碱+AgNO3 嘌呤碱的银化物(3)(NH4)2MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+ 12H2MoO4 H3P(Mo3O10)4+12H2O+抗坏血酸钼蓝 (660nm) 浓氨水器材和试剂器材:乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、 量筒、吸管、滴管、试管及试管架、烧 杯、离心机、漏斗试剂:0.2%氢氧化钠溶液、5%硝酸银溶液冰醋酸、干酵母、 95%乙醇 、10%硫酸溶液、浓氨水 苔黑酚三氯化铁溶液定磷试剂 (1)17%硫酸溶液 将17ml浓硫酸(比重1.84)缓缓加入 到83ml水中。(2)2.5%钼酸铵溶液 将2.5g钼酸

4、铵溶于100ml水中。(3)10%抗坏血酸溶液 10g抗坏血酸溶于100ml 水中,贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用,如 呈深黄或棕色则失败,需纯化抗坏血酸。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17%硫酸溶液:2.5%钼酸铵溶液:10%抗坏血酸 溶液:水=1:1:1:2(V/V)操作 1、提取核糖核酸5g酵母+30ml0.2%氢氧化钠 研磨均匀 锥形瓶,微波加热5分钟,冷却,离心( 4000r/min)10分钟,取上清液,滴加冰 醋酸使提取液呈酸性(pH56,石蕊试纸 试之),加30ml95%乙醇溶液。注意要一 边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完 全,离心(3000r/min)3分钟,9

5、5%乙醇 (每次约10ml)洗涤沉淀两次(即离心) 。 2、组分鉴定 提取核酸+10%硫酸溶液5ml 10分钟 水解液组分鉴定:1)嘌呤碱:硝酸银溶液1ml +过量浓氨水, 出现沉淀到沉淀消失,再滴加1ml水解液, 观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。(注意 先后顺序)2)核糖 水解液0.5ml+苔黑酚三氯化铁 溶液1ml,加热至沸1分钟,观察溶液颜色 变化。沸水浴 3)磷酸 水解液1ml+定磷试剂1ml观察现象实验结果:水浴苔黑酚法测RNA的含量n1、标准曲线的绘制012345RNA标 准液ml00.40.81.21.62.0蒸馏水 ml2.01.61.20.80.40苔黑酚 试剂ml2.02.02.02.02.02.0混匀,沸水浴2545min,冷却,测各管 A670nm,以A670nm为纵坐标,RNA量(ug) 为横坐标作图。n2、样品的测定1.0ml样液+1.0ml蒸馏水+2.0ml苔黑酚 试剂,混匀,沸水浴2545min,测A670nm,根据标准曲线求得RNA的质量(ug).

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