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1、DNA Analysis By Flow Cytometry核医学生物技术重点实验室Key lab of Medical College of Su Zhou University基本原理概述 正常人静止体细胞有46条染色体，相当于 7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体 细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含 量。在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各 个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性 的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的 合成，但DNA含量仍保持二倍体；Key lab of Medical College of Su Zhou University 进
2、入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内 DNA的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制 结束成为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞 继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此 ，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一 旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这 两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进 入静止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样 无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以 描述为G0/G1，S，G2/M期。Key lab of Medical College of Su Zhou University 通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪 进行分析，可以得到细胞各个时期的
3、分布 状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，了 解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中 ，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状 态的指标。正常细胞具有较恒定的DNA含 量，而细胞癌变过程中结构和/或染色体的 异常是很常见的。这种变化在流式分析中 以DNA倍体指数的形式表现出来，这一指 数对于肿瘤的早期诊断，交界瘤、间叶组 织肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指 标。 Key lab of Medical College of Su Zhou University流式DNA周期示意图G0/G1静止期及合成前期S合成期 G2/M合成后期及分 裂期Key lab of Medical Colle
4、ge of Su Zhou University样本制备 来源于血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手 术活检、细针穿刺物等的细胞都可用来做 DNA分析。新鲜的、冰冻或固定保存的、或 常规固定/包埋用于组织检查的样本均可。通 常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。用组 织切片的好处是可以通过观察常规染色来选 择感兴趣的区域，缺点是不能再用抗体染色 来鉴别肿瘤细胞和正常基质细胞。Key lab of Medical College of Su Zhou University实体标本的单细胞制备 机械法：用剪刀、刀片剪切组织或金属网研 磨获取完整的细胞。但该法获取的细胞数量 少。 化学药品处理法：利用EDT
5、A或Sodium citrate 结合Ca2+或Mg2+等阳离子，破坏细胞间的连 接或用Triton X-100、NP-40破坏细胞膜。该 法只能取得细胞核，且易出现核凝集。 酶法：利用酶将细胞间的连接物水解，使细 胞从组织中分离出。一般常用的为胃蛋白酶 及胰蛋白酶。该法也只能取得细胞核。Key lab of Medical College of Su Zhou University细胞浓度及质量要求 单细胞和核的最终浓度应约106/ ml。浓度太 低，上机时样本的流速不得不提高，这样就 会影响检测的CV。浓度太高，则可能导致染 料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影 响CV和检测结果。 制备
6、完成后的标本应用光学显微镜检查其质 量：细胞是否聚集或过多的碎片；大多数核 有肿瘤样的外观(比如说，不是粒细胞)等。 保证足够的肿瘤细胞含量；检测S%时建议的 最小可接受比例是20%。Key lab of Medical College of Su Zhou University固定 常用70%的冰酒精固定单细胞悬液。应保证 样本完全浸没在固定剂中置40C冰箱固定4小 时上。 对于甲醛固定的组织切片，应注意甲醛会影 响PI与核酸的结合。若同时使用抗体鉴别肿 瘤细胞，应选择对抗原无损的固定剂。对许 多细胞 表面抗原来说，固定只能在抗体标记 之后进行。Key lab of Medical Coll
7、ege of Su Zhou University染色 染料的选择取决于流式激光的配置。488nm 的激光下应用PI(碘化丙啶)，由于PI也与双链 RNA结合，所以分析前样本应用Rnase处理。 重要的是染料要足够，以保证饱和结合。PI 的推荐浓度是至少20ug/106 个细胞。其最佳 浓度为50ug/106 个细胞。在室温1.15为超二倍体；DI0.85为 亚二倍体。） 但对于四倍体和G2/M期的判断，一般用 G2/M占G0/G1的20%以上即算四倍体。Key lab of Medical College of Su Zhou University浆膜腔脱落细胞良恶性判断标准1.出现DNA的
8、非整倍体峰为恶性肿瘤细胞 。 2.无明显的非整倍体峰，但有一突出的四 倍体峰和大于15%的S期细胞，并伴有 G0/G1期CV值大于9%为恶性肿瘤细胞 。 3.无明显的非整倍体峰，但 G0/G1期CV 值增大，并伴有大于10%15%的S期和 一个突出的四倍体峰，诊断为可疑癌。Key lab of Medical College of Su Zhou University结果报告 报告中至少应包含以下信息： (1)DNA倍体，包括所有群体的DI； (2)主要G1峰的CV； (3)S期比例； (4)必要的简单评价：如细胞数的不足、碎片 较多、CV太高等。Key lab of Medical College of Su Zhou University
