大肠杆菌表达系统使用指导

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1、（二）融合蛋白技术的内容构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有：1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及 测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。 （三）融合蛋白技术的关键 在构建融合

2、蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。 有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用， 并获得了满意的结果。 但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选择几种融合方式， 从中优化出理想的连接方式。 另外，大量研

3、究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。 常用的融合蛋白的载体有人血清白蛋白( Huma serum albumin， HSA) 融合蛋白、 -半乳糖苷酶融合蛋白、 谷胱甘肽 S-转移酶(GST) 融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx) 融合蛋白等。 而人血清白蛋白( HSA) 则由于本身特殊的优点， 更适合于充当长效融合蛋白类 药物的融合载体。 HSA是包含585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质， 分子量65kD。它是人血浆中含量最高的单一蛋白质(达40g/L)， 在体内有维持血液渗透压， 运输营养和其它重要生物物质的作用。HSA本身是许多内源因子和外源药物的载体。

4、药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利用度， 增加在体内的半衰期至19d之久。 人血清白蛋白融合技术具有明显 的优点，包括：HSA与目标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接， 不需额外的体外处理；HSA表达水平较高， 融合后可以提高目的蛋白的表达水平；HSA是一个稳定的“ 惰性” 蛋白， 融合后可以提高目的蛋白的稳定性 ； HAS融合蛋白具有比PEG修饰的蛋白药物更长的半衰期 。 （三）细胞因子重组融合蛋白细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发

5、挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。按生物学功能的不同可分为：细胞因子与抗体的融合蛋白、细胞因子与毒素的融合蛋白、不同细胞因子的融合蛋白、 细胞因子与细胞因子受体的融合蛋白以及细胞因子与其他分子的融合蛋白。这些兼具特异 性与高效性的新型重组融合蛋白有些已走向临床， 在抗肿瘤、 抗风湿病、抗 HIV感染等领域发挥作用， 为人类疾病的治疗提供新的手段。1、细胞因子与毒素的融合蛋白 在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞因子受体， 可利用细胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境以杀伤肿瘤细胞。白喉毒素与细胞因子的重组融合蛋白便是这样一类能直接杀伤靶细胞的免疫制剂。2、细胞因子与细胞因

6、子受体的融合蛋白 通过将在体内发挥作用时相互依赖或者所具有的协同作用细胞因子与细胞因子受体基因重组， 可大大促进其生物学活性的发挥。IL- 6在肝细胞的增殖中起着增强作用。IL-6和IL-6R(gp80)的结合使其易于和另一个受体IL-6R (gpl30)结合。体系选择体系选择研究基因功能研究基因功能: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 裂殖酵母裂殖酵母, ,昆虫细胞昆虫细胞, CHO, CHO细胞细胞 多肽药物生产多肽药物生产: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 毕氏酵母毕氏酵母, CHO, CHO细胞细胞, , 乳腺组织乳腺组织 疫苗疫苗: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 酵母酵母, , 大多数沿用细胞培

7、养产物进行灭毒大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产单抗生产: : 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 工业酶生产工业酶生产: : 各种微生物各种微生物 按蛋白质类型分按蛋白质类型分 单纯表达单纯表达: : pJLApJLA系列系列, , 用用NcoINcoI/ /NdeINdeI导入导入AUGAUG的载体的载体 融合表达融合表达: : 融合各种融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etctag, GST, CBD, MAL, GFP, etc分泌表达分泌表达: : pelpel/ /ompTompT分泌肽分泌肽 按启动子分按启动子分 laclac及衍生的及衍生的tactac , ,

8、trctrc, , pacpac, , racrac等启动子等启动子 IPTGIPTG诱导诱导 lamdalamda phage P phage PL L和和P PR R启动子启动子 热热诱导诱导 T7 T7 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 T5 T5 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 araara启动子启动子 阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类大肠杆菌表达载体分类 pJLA50XpJLA50X系列系列; ; pcDNAIIpcDNAII; etc; etc pETpET系列系列 (T7 promoter, (T7 promoter, NovagenNovagen公司公

9、司) ) pQEpQE系列系列 (T5 promoter, (T5 promoter, QiagenQiagen公司公司) ) pMALpMAL系列系列 ( (周质表达周质表达, , BioLabsBioLabs公司公司) ) pGEXpGEX系列系列 (GST(GST融合表达融合表达, Pharmacia, Pharmacia公司公司) ) pBADpBAD系列系列 ( (ArabinoseArabinose诱导型诱导型) )常用表达载体常用表达载体 pTYBpTYB系列系列 (CBD(CBD融合融合, , 可以自我切割可以自我切割, BioLabs), BioLabs) Protein A

10、 Protein A GSTGST（glutathione S-glutathione S-transferasetransferase） CBD (chitin-binding domain, CBD (chitin-binding domain, BioLabsBioLabs; ;cellulose-binding domain, cellulose-binding domain, NovagenNovagen) )calmodulincalmodulin-binding domain, -binding domain, StratageneStratagene) ) MBP (malto

11、se-binding protein)MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein)GFP (green fluorescence protein) ThioredoxinThioredoxin * *帮助二硫键形成帮助二硫键形成 DsbDsb ( (periplasmaperiplasma enzyme enzyme DsbADsbA, , DsbCDsbC) ) * * 二硫键的形成与二硫键的形成与 SUMO (small SUMO (small ubiquitinubiquitin-related modifi

12、er) -related modifier) KSI (KSI (ketosteroidketosteroid isomeraseisomerase) ) 基本上全部沉淀基本上全部沉淀各种融合蛋白表达载体各种融合蛋白表达载体帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化 His-tag (His-tag (6-8 Histidine6-8 Histidine) ) T7-tag (T7-tag (MASMTGGQQMGMASMTGGQQMG) ) HSV-tag (HSV-tag (QPELAPEDPEDQPELAPEDPED) ) S-tag (S-tag (KETAAKFERQHMDSKETAA

13、KFERQHMDS) ) VSV-G-tag (VSV-G-tag (TTDIEMNRLGKTTDIEMNRLGK) ) HA-tag (HA-tag (YPYDVPDYAYPYDVPDYA) ) Flag-tagFlag-tag ( (DYKDDDDKDYKDDDDK) ) Myc-tag (Myc-tag (EQKLISEEDLEQKLISEEDL) )各种用于抗体识别的标记各种用于抗体识别的标记 BiotinylationBiotinylation-tag-tag100100多多AAAA的结构域的结构域, , 在大肠杆菌中被识别为生物在大肠杆菌中被识别为生物 素化的位点素化的位点. .

14、PromegaPromega的的PinPointPinPointTMTM Xa-1; Xa-1; InvitrogenInvitrogen的的pET104-DEST.pET104-DEST. 未命名未命名DVEAWLGAR, DVEAWLGAR, 被用来和被用来和streptoavidinstreptoavidin结合结合( (个人通讯个人通讯) ) 未命名未命名一些病毒外壳蛋白的片段一些病毒外壳蛋白的片段, , 破坏细胞膜的结构导破坏细胞膜的结构导 致容易进入细胞致容易进入细胞有前景的特殊用途的有前景的特殊用途的tagtag DTT: DTT: inteinintein的的 CysCys 溴化氰溴化氰: : Met Met Thrombin: Thrombin: LVPRLVPR GS GS Factor Xa: Factor Xa: IEGRIEGR Enterokinase: Enterokinase: DDDDKDDDDK PreScissionPreScissionTMTM protease: protease: LEVLFQ LEVLFQ GPGP Genenase IGenenase I TMTM PGAAHYPGAAHY TEV protease:TE