12基因工程的基本操作程序

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1、 基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：提取提取棉花细胞棉花细胞( (含含抗虫基因抗虫基因) )苏云金芽苏云金芽 孢杆菌孢杆菌抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNADNA拼接拼接导入导入普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )棉花植株棉花植株( (有有抗虫特性抗虫特性) )基因工程的基本操作程序n（1）目的基因的获取n（2）n（3）将目的基因导入受体细胞n（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建一、目的基因的获 取 1 1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结结 构基因构基因，也可以是一些具有调控作用的因，也可以是一些具有调控作

2、用的因 子。子。 2 2、获取方法：、获取方法： （1 1）从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因； （2 2）利用利用PCRPCR技术扩增目的基因；技术扩增目的基因； （3 3）通过）通过DNADNA合成仪用化学方法直接合成合成仪用化学方法直接合成（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体受体菌的群体中， 各个受体菌分别含有这种生物的不同基 因，称为基因文库。基因文库基因组文库部分基因文库 （cDNA文库）基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较补：原核细胞的基

3、因结构非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点 ，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动， 并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA 聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 编 码 区非 编 码 区原 核 细 胞 的 基 因 结 构有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 启动子终止子补：

4、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 真 核 细 胞 的 基 因 结 构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子结构基因外显子内含子 转录、加工修饰mRNA原核细胞真核细胞 不同点编码区是 _的编码区是间隔的 、_的相同点都由能够编码蛋白质的_ _ 和具 有调控作用的_ 区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构

5、比较思 考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续 编码区 非编码基因表达的计算基因表达的计算n n在真核生物中，对应的是在真核生物中，对应的是 的碱的碱 基数基数DNAmRNA蛋白质转录翻译6 63 31 1氨基酸数氨基酸数碱基数碱基数基因中外显子基因中外显子基因组 文库与 部分基 因文库 的关系基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较文文库类库类库类库类 型型cDNAcDNA文文库库库库基因基因组组组组文文库库库库文文库库库库大小大小基因中启基因中启动动动动子子基因中内含子基因中内含子基因多少基因多少物种物种间间间间基因交流基因交流小

6、大无有无有某种生物的部分基因 某种生物的全部基因可以部分基因可以基因文库与基因库 基因库是指某一生物群体中的全部基因。 基因文库与基因克隆基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段 的克隆。 基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后 可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。 基因组文库的构建模式图通过对 受体菌 的培养 而储存 基因2.基因文库的构建方法（1） 鸟枪法（2） 反转录法（3）根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA 法法 人人 工工 合合 成成 法法（真核生物真核生物）多用于原核生物多用于原核生物直接分离法（1）鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与

7、载体连接受体细胞产生特定性状导入 外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)以目的基因转录成的信使RNA为模板， 再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA ，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA ，即cDNA，从而获得所需的基因。（2）反转录法（cDNA文库的构建方法）（3 3）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：根据已知蛋白根据已知蛋白 质的氨基酸序列，质的氨基酸序列， 推测出相应的信使推测出相应的信使 RNARNA序列，然后按序列，然后按 照碱基互补配对原照碱基互补配对原 则，推测出它的结则，推测出它的结 构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序 列，再通过化

8、学方列，再通过化学方 法，以单核苷酸为法，以单核苷酸为 原料合成目的基因原料合成目的基因 。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基 酸合成DNA法操作简便 广泛使用工作量大，盲目， 分离出来的有时并 非一个基因专一性强操作过程麻烦， mRNA很不稳定，要 求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸 对较少的简单基因思考：思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：

9、目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。注意：注意：u基因文库中不是直接保管相应基因， 而是保存受体菌，菌中含基因。（二）（二）利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点适温延伸3 高温变性1 低温退火2 重复13步 2530轮目的DNA片段 扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链 与引物复性DNA变性 形成2条单链子链延伸 DNA加倍模板DNA95PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程n

10、PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束 第2轮开始PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。 前提条件：_；原料：_、_ 、 _、 _。原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数） 结果：聚合酶链式反应 体外特定DNA片段DNA复制

11、已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸DNA引物 热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNAn 过程：变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90 95双链DNA解链成 为单链DNA 退火：冷却至55 60部分引物与模 板的单链DNA的特定 互补部位相配对和 结合 延伸：加热至70 75以目的基因为 模板，合成互补的 新DNA链变性退火延伸过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互

12、补的_。 氢键单链DNA双链DNA链思考？1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为为循环环次数)（24-1）2=30n模板DNAn 特异性引物n耐热DNA聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCR体系基本组成成分一对寡核苷酸序列：与目的基因 的起始段互补PCR总结：PCR的基本反应步骤变性 90-95C延伸 70-75C退火 55-60CPCR总结：TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermusthermus aquaticusaquaticus) )酶活性酶活性(%)(%)温度温度()40 50 60 70 80 90 1001008060

13、4020PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制 相 同 点原理 原料 条件不 同 点解旋 方式 场所酶结果碱基互补配对 四种脱氧核苷酸模板、能量、酶 DNA在高温下 变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点重复30轮后 230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增 第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn 循环次数实际拷贝数=(1+x)nX 平均效率,约为0.85n 循环次数根据已知蛋白质 的氨基酸序列，推测 出相应的

14、mRNA序列， 然后按照碱基互补配 对原则，推测出它的 结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法 ，以单核苷酸为原料 合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（三）化学方法人工合成目的基因人人工合成工合成 ( (基因比基因比较小较小) )DNADNA合成仪合成仪q从基因文库中获取q利用PCR技术扩增q利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。用_切断目的基因，使其产生_。将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末

15、端切口 DNA连接酶1.过程:二、构建表达载体 核心质粒DNA分子限制酶处理一个切口 两个黏性末端两个切口 获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:2.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败 ，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载 体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗 虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子( 抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花 植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子 、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端 )，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗 虫能力。 资资 料料: :思考：思考：作为基因工程表达载体， 只需含有目的基因就可以完成任务 吗？为什么？（P15）不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达 并发挥作用，还需要有其他控制元件，如 启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要