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1、药物体内代谢产物的研究方法周婷药物体内代谢产物的研究方法 药物代谢的基本概念 药物代谢转化的研究方法生物样品的前处理药物及其代谢物的分析和鉴定技术 小结药物代谢(drug metabolism) 药物的代谢又称药物的生物转化 (biotransformation)，是指药物经过体内 吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化 学结构变化的过程。 多数药物经过代谢转化,失去活性或降低了 活性。但是,也有的药物经代谢转化提高了 活性,生成药理活性更强或者毒性更大的代 谢物。 普鲁卡因 氯丙嗪硝酸异山梨酯5-单硝酸异山梨酯药物代谢过程 I相代谢反应 (phase I reactions)氧化、还原和水解
2、相代谢反应 (phasereactions)与葡萄糖醛酸、 硫酸、氨基酸的结合反应 (conjugation)药物生物转化的过程药物代谢转化的研究方法 In vivo 体内代谢法是在给药动物服药后经过一定时间收 集动物的尿样、血样或胆汁，分离检测样品中药物及其 代谢物。该法最早在50年代已被采用，迄今仍然广泛应 用。实验时应注意动物和人在代谢方面异同点。 In vitro 由于药物在生物体内分布极广，其代谢转化的脏 器和酶系统多样化，使药物及其代谢产物在体内的浓度 较低，尤其是一些毒副作用较大的药物如抗癌药等，服 用剂量有限，代谢物的浓度更低，直接从血浆、胆汁等 生物体液中分离检测代谢物进行体
3、内代谢转化研究具有 一定的困难。于是利用体外代谢法研究代谢转化尤其在 确定代谢物的结构受到普遍重视。药物的体内代谢研究法 体内生物转化方法是通过人或动物直接服用药 物，然后收集尿样、胆汁、血样、粪便等进行 代谢产物分析。 药物的主要代谢部位是肝脏，药物在肝脏被代 谢后，代谢产物的一部分通过胆汁排入肠道， 另一部分进入血液向身体其他部位分布，最终 代谢物从粪便、尿液中排出。口服吸收的药物 的另一代谢部位是肠道，药物经肠内菌及其酶 代谢后代谢产物，一部分通过“肝肠循环”吸收入 血液，分布至其他部位，最终代谢产物从尿液 、粪便中排出体外。 生物样品的预处理技术 (pretreatment of bi
4、ological matrices) 脱蛋白(deproteinization) 液-液萃取(liquid-liquid extraction,LLE) 固相萃取 (solid phase extraction，SPE) 脱蛋白 (deproteinization) 表1 常用蛋白沉淀剂(protein precipitation ) 蛋白沉淀剂类 型 常用蛋白沉淀剂 水溶性有机溶剂 乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋 喃等 中性盐 饱和硫酸氨、硫酸钠、镁盐 、磷酸盐、枸橼酸盐 等 强酸 10%三氯醋酸、6%高氯酸、硫酸-钨酸混合液、 5%偏磷酸等 锌盐 和铜盐 沉淀 剂 硫酸铜-钨酸钠混合
5、液、硫酸锌-氢氧化钠混合液 等 微孔滤膜法 仅用于测定样品中的游离代谢产物，与蛋 白结合的代谢物不能被滤过液-液萃取法 (liquid-liquid extraction,LLE) 原理 多数药物是亲酯性的，而血样或尿样中含 有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性 物质。因而用有机溶剂提取可以除去大部 分杂质。 挥去溶剂法 生物样品加入提取溶剂混匀离心吸 出上层溶剂挥去溶剂(通入氮气流吹干)例子 钟皎等3以甲巯咪唑为内标，用乙醚提取 Na2C03碱化后的大鼠尿液，测定了其中 的盐酸雷诺嗪及其代谢物。 LLE的缺点 但是液-液萃取法可能产生的乳化现象会 引起药物的损失。通常在提取前加入适量 的固体
6、氯化钠，可减轻乳化程度。 离子对萃取法 (ion-pairextraction method) 许多药物的代谢产物在一定的pH条件下以 离子状态存在。因此，可以控制样品溶液 的pH，并向其中加入反离子以形成离子对 ，再用有机溶剂提取。 ion-pairextraction methodQ+aq + X-aq QX 被测药物 反离子 离子对碱性药物:烷基磺酸类 RSO3H酸性药物: 烷基季氨R4H+X-固相萃取 (solid phase extraction， SPE) SPE的基本原理是基于样品在固相和液相 之间的分配差异。有两种洗脱模式: 一种是药物比杂质与固相之间的亲和力更 强，因而被保留
7、，然后用一种对药物亲和 力更强的溶剂洗脱； 另一种是杂质较药物与固相之间亲和力更 强，则药物被直接洗脱。通常使用的为前一种模式 Principle of solid-phase extraction 固相萃取柱 现代SPE方法采用长约2 3cm的聚丙烯小柱，内装各 种填料。SPE的填料种类繁 多，可分为: 亲脂型（大孔吸附树脂、亲 脂性键合相硅胶） 亲水型（硅胶、硅藻土、棉 纤维） 离子交换型实验步骤如下 第一步，使用甲醇润湿小柱，活化填料，以使固相表面 易于和被分析物发生分子间相互作用，同时，可以除去 填料中可能存在的杂质。C18柱在甲醇含量大于8的水 溶液中才能保持湿润而有利于药物的吸附，
8、否则，将导 致回收率的降低； 第二步，用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移过多的甲 醇，以便样本与固相表面发生作用。但清洗不宜过分， 否则会使甲醇含量过低，从而导致湿润度不足，回收率 降低； 第三步，加样，使样本经过小柱，弃去废液； 第四步，用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移样本中的 内源性杂质和其他相关杂质； 第五步，选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱 液，挥干溶剂以备后用，或直接进行在线分析。Solid-phase extraction procedure 冰冻干燥法 一些水溶性大、不易以液-液萃取法提取 的药物代谢产物，也可用冰冻干燥法来处 理样品，即先将样品冰冻干燥，再用甲醇 等极性溶
9、剂将代谢产物从干燥的残渣中提 取出来 分析和鉴定技术 高效液相色谱法 气相色谱法 高效毛细管电泳 核磁共振技术 质谱技术 色谱-光谱联用技术 高效液相色谱法 NP-HPLC(包括吸附色谱及键合相色谱)及 RP-HPLC均可用于I相代谢产物及甲基化 和乙酰化代谢产物的分离分析。RP- HPLC(包括离子对色谱及离子抑制色谱) 适合于分离分析极性较大的、水溶性的结 合型相代谢产物。如果要制备供结构鉴 定用代谢产物纯品，应采用制备型HPLC 。制备用HPLC技术 要制备供结构鉴定用代谢产物纯品，应采 用制备型HPLC。 气相色谱法 由于代谢产物极性比较大，因此在进行GC分析 前一般需要进行衍生化，以
10、改善色谱行为，增 加稳定性，提高定量测定的准确度。代谢产物 结构中常见的活性基团有羟基、羧基及氨基， 三甲基硅烷化(TMS)可适用于多数中性及碱性代 谢产物的衍生化。对于同时含有羟基及羧基的 酸性代谢产物往往可以先甲酯化(ME)，再硅烷 化，这样可使所有的羧基全部转化为甲酯，而 所有的羟基均被TMS衍生化。上述反应是快速 且定量地进行的。甲酯化最方便的试剂是重氮 甲烷，该试剂可使羧基变成甲酯，但不与羟基 发生反应。高效毛细管电泳 80年代末发展起来的高效毛细管电泳，近年来 在药物代谢研究中得到广泛应用，如Tomlinson 等69应用电喷雾接口的CE-MS研究麻醉剂氟哌 啶醇在肝微粒体中的代谢
11、，分离鉴定了6种代谢 物，并阐明其代谢特征。Kobayashi等70应用 胶束毛细管电泳分离分析游离型和结合型甾体 的代谢物。Li等71应用毛细管电泳结合改进的 环糊精手性试剂研究Oxprenolol对映异构体代谢 ，确定其代谢立体选择性。毛细管电泳因柱效 高，每米塔板数可达100万，结合手性试剂能够 有效分离手性化合物，有望成为研究手性药物 代谢立体选择性及药代动力学强有力的工具。核磁共振技术 NMR技术可以直接提供代谢物分子结构信息， 样品用量少，一维谱的测定仅需5min，是一种 快速、简便的方法。2D-COSY，2D-NOE谱的 应用为分子结构提供了更多信息，使分子结构 鉴定工作更为容易
12、10。人及大鼠尿液的1H NMR谱中0.41.7的区域是内源性物质信号相 对简单的区域，可用于观察代谢物的CH3、 CH2、CH信号。另外，6.08.5的芳香氢区域 质子信号也可以方便地用于研究代谢产物的分 子结构。质谱技术 质谱技术由于其检测灵敏度高，分析的分子质量范围宽 ，提供分子结构信息量多等特点，已成为研究药物代谢 产物的重要手段。药物在体内发生代谢转化后，一般仅 在母体药物的基础上进行部分结构修饰，药物母体结构 一般不会有太大变化，因此代谢物与母体药物常有相似 的质谱特征离子，据此可对代谢物进行识别，并结合其 他碎片特征，对其结构作出合理推断，但需将代谢物的 电子轰击(EI)MS谱与
13、合成品MS谱相对照，化学结构最 终还要借助核磁共振图谱来确定。亦可用多级质谱分析 技术(MSn)直接获得母体分子和代谢物分子结构信息， 此时毋需制备纯代谢产物，生物样品只需经过简单的预 处理。色谱-光谱联用技术 LC/DAD联用 GC/MS联用 HPLC/MS联用 HPLC/NMR联用 HPLC/NMR/MS联用 LC/DAD联用 反相HPLC结合二极管阵列检测器(DAD)，即LC/ DAD 联用可在生物样品众多的色谱峰中搜寻可能的代谢产物 峰。该分析技术的出发点主要有两个：(l)药物的代谢转 化多数是对母体药物的结构加以修饰，并未改变母体药 物的结构骨架，因此多数代谢物的结构类型一般与母体
14、药物一样或相似，故其紫外光谱特性也与母体药物一样 或相似。(2)在一般情况下，药物代谢转化成代谢物后， 极性增大，所以在反相HPLC色谱图中，代谢物峰一般 出现在原型药物峰之前。 LC/ DAD联用技术仅用于HPLC色谱图中代谢物峰的初 步搜寻与判断，起到“眼睛”的作用。有关代谢产物的结 构还需通过进一步的试验确证。彭莹等11用梯度洗脱 (RP) HPLC/DAD法初步鉴别了异靛甲的10个代谢产物 。GC/MS联用 GC法对样品的极性和热稳定性有一定的要求， 而代谢产物一般具有一定的极性基团，故其熔 点高、挥发性差，因此需要进行衍生化后用 GC/MS分析。对于相代谢产物，由于其与葡 萄糖醛酸、
15、硫酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等结合 后不易完全衍生化或制成衍生物后结构太大仍 不易气化，故其一般需先经水解后，再进行衍 生化才能用GC/MS分析。如沙美特罗在小鼠尿 中的4个代谢产物是通过尿样经葡萄糖醛酸苷酶 酶解，再用N-甲基-三甲基硅烷基三氟乙酰胺 (MSTFA)衍生化后，用GC/MS分析得以鉴定 12。HPLC/MS联用HPLC/MS联用技术集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强 的定性专属性于一体，并且有如下特点13：获得复杂混合物中 单一成分的质谱图，大大有利于药物、药物代谢物和内源性化合物 的分离与鉴定；可分别定量测定生物体液中药物及其代谢物。 与GC/ MS联用技术相比较，HP
16、LC/ MS的样品前处理简单，一般不 要求水解或者衍生化处理，可以直接用于药物及其相、相等极 性较大的代谢物的同时分离和鉴定。由于DAD为非破坏性检测器， 故通常在HPLC与MS之间插入DAD检测器形成HPLC/DAD/ MS， 这样HPLC色谱图中各峰先由DAD采集紫外光谱图，检测代谢产物 及其纯度，再由MS采集质谱图，即色谱图中各峰经过DAD及MS的 双重鉴别，因此提高了代谢产物峰辩识的准确性。丁黎等采用 LC/DAD/MSD技术，从大鼠服药胆汁中鉴定了6种盐酸非洛普I相代 谢产物14 ；在研究相代谢产物时，以 HPLC法制备 II相代谢产 物馏分并以-葡糖醛酸酶水解 ,再进行分析，最后得出3种盐酸非洛
