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1、实验三 食品中蛋白质含量测定 （凯氏定氮法）标准依据：50095-2003食品中蛋白质含量测定n一、目的与要求n1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。n2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的 消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。n二、实验原理n蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化 剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与 硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加 碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标 准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换 算系数，即得蛋白质含量。n因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质 ，所以此蛋白质称为粗蛋白。三、仪器与试剂n（一）试剂n1、硫酸铜（CuSO
2、45H20） n2、硫酸钾n3、硫酸（密度为1.8419g/L）n4、硼酸溶液（20g/L）n5、氢氧化钠溶液（400g/L）n6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。n7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。n8、黄豆粉。（二）仪器n微量定氮蒸馏装置：n n1、电炉； 2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺 旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5 、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8 、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。四、实验步骤n1、样品消化n 称取黄豆粉约0.3g（0.001g），移入干燥的100mL 凯氏烧瓶中，加入
3、0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶 口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于 有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消 化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止 后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透 明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷 后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度， 混匀备用，即为消化液。n n 试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸 钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定 容至100mL，得试剂空白消化液。 2、定氮装置的检查与洗涤n检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内 装水约三分之
4、二，加甲基红指示剂数滴及数毫 升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（ 或沸石）以防止暴沸。n测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样品进 口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通 入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟 后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反 应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数 次，即可使用。3、碱化蒸馏n量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂23 滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a关 闭，螺旋夹b开启的状态下，准确吸取10.0mL样品消 化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进 样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。使10mL氢氧化钠溶 液倒入小
5、玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少 量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气 ，开启螺旋夹a，关闭螺旋夹b，开始蒸馏。通入蒸汽 蒸腾10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸 馏2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三 角瓶，准备滴定。n同时吸取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操作。n4、样品滴定n以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。n5、数据记录n样品消化液（mL）n消耗盐酸标准溶液平均值（mL）（三次测定的 平均值）五、结果计算n式中 X样品蛋白质含量（g/100g）；nV1样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；nV2空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（
6、mL）；nc盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；n0.0140 1.0mL盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；nm样品的质量（g）；nF氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品 为6.38；面粉为5.70；高梁为6.24；花生为5.46；米为 5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、 小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。n计算结果保留三位有效数字。六、注意事项及说明n1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。半固体试样一般取 样范围为2.00g5.00g；液体样品取样10.0mL25.0mL（约相当氮 30mg40mg）。若检测液体样品，结果以g
7、/100mL表示。n2、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以 免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体 石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。n3、消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品 彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却 ，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。n4、硼酸吸收液的温度不应超过40，否则氨吸收减弱，造成检测 结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。n5、在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术 平均值的10%七、思考题n1、预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作 。n2、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入 量对测定结果有何影响？n3、在蒸汽发生瓶水中、加甲基红指示剂数滴 及数毫升硫酸的作用是什么？若在蒸馏过程中 才发现蒸汽发生瓶中的水变为黄色，马上补加 硫酸行吗？n4、实验操作过程中，影响测定准确性的因素 有哪些？
