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1、转基因植物的鉴定w 进行基因转化后，外源基因是否进入植 物细胞，进入植物细胞的外源基因是否 整合到植物染色体上，整合的方式如何 ，整合到染色体上的外源基因是否表达 ，这一系列的问题仍需回答，只有获得 充分的证据后才可认定被检测的材料是 转基因的。w 目前认为转基因植物的证据应有以下几点： w 要有严格的对照（包括阳性及阴性对照）； w 转化当代要提供外源基因整合和表达的分子 生物学证据、物理数据（southern杂交， northern杂交，western杂交）与表型数据（酶 活性分析或其它）； w 提供外源基因控制的表型性状证据（如抗虫 、抗病等）； w 根据该植物的繁殖方式（有性繁殖还是无
2、性 繁殖）提供遗传证据。有性繁殖作物需有目的 基因控制的表型性状传递给后代的证据，无性 繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。w 外源基因整合的鉴定 w 证明外源基因在植物染色体上整合 的最可靠的方法是DNA Southern分子杂 交，只有经过分子杂交鉴定过的植物才 可以称为转基因植物。w 核酸分子杂交是指非同一分子来源但具 有互补序列（或某一区段互补）的两条 多核苷酸链，通过碱基配对形成稳定的 双链分子的过程。 w 若其中的一条链被人为标记上，该标记 可以通过某种特定方法检出，即成为所 谓的探针。w 探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂 交体也就带上了同样标记，可被检测出 来。 w 这样，以特定
3、的已知核苷酸序列做探针 ，就可以在诸多的核苷酸序列中，通过 杂交探测出与其互补的序列，因而分子 杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定 及检测外源基因整合表达的强有力手段 。w 它具有灵敏性高（可检出10-12g，即1pg DNA样品）、特异性强（可鉴别出20个 碱基对左右的同源序列）的特点，是当 前鉴定外源基因整合及表达的权威方法 。 w 根据杂交时所用的方法，核酸分子杂交 又可分为印迹杂交、斑点（dot）杂交、 狭槽（slot）杂交和细胞原位（in situ） 杂交等。w 鉴定转基因植株所涉及到的核酸分子 杂交有Southern杂交及Northern杂交。 w Southern杂交是以DNA或
4、RNA为探针， 检测DNA链，不仅可鉴定外源基因的 整合，还可初步鉴定插入的拷贝数。w PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）的简称。 w 它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用， 根据检测的目的片段及一定的原则设计引物 ，与模板DNA经过变性、退火、延伸三步骤 的数个循环，对特异DNA序列进行扩增，可 以在一只小小的离心管中几小时内使目的 DNA片段扩增数百万倍。w PCR检测所需的模板量仅为10ng以内， 而且粗提的DNA就可以得到良好的扩增 效果，因而这一技术的出现为外源基因 整合的检测提供了便利条件，尤其是在 转化材料少又需及早检测的时候。 w 但
5、由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现 假阳性扩增，因此检测的只是初步结果 。外源基因转录水平的鉴定w 基因表达分为转录及翻译两阶段，转录 是以DNA（基因）为模板生成mRNA的 过程，翻译是以mRNA为模板生成蛋白 质的过程，检测外源基因的表达就是检 测特异mRNA及特异蛋白质的生成。w 所以基因表达检测分为两个水平：即转 录水平上对特异mRNA的检测和翻译水 平上对特异蛋白质的检测。w 转录水平上的检测主要方法是Northern 杂交，它是以DNA或RNA为探针，检测 RNA链。 w 和Southern杂交相同，Northern杂交包括 斑点杂交和印迹杂交。w 也可用RT-PCR（revers
6、e transcribed PCR）方 法检测外源DNA在植物体内的转录表达。 w 其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行 反转录，然后再经PCR扩增。 w 如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA 扩增条带，则表明外源基因实现了转录。 w 此法简单、快速，但对外源基因转录的最后 决定，还需与Northern杂交的实验结果结合。外源基因表达蛋白的检测 w 表达蛋白的检测方法有三种：生化反 应检测法：主要通过酶反应来检测； 免疫学检测法：通过目的蛋白（抗原） 与其抗体的特异性结合进行检测，具体 方法有Western杂交、酶联免疫吸附法（ ELISA）及免疫沉淀法；生物学活性 的检测。w
7、Western杂交是将聚丙烯酰胺凝胶（SDS- PAGE）电泳分离抗原（Antigen）固定在固体 支持物上（如硝酸纤维素膜，NC膜）。 w 不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移率不 同，据此可确定特定的抗原存在与否以及相 对丰度，或者蛋白质是否遭到降解等。 w 蛋白质电泳后转到NC膜，放在蛋白质（如牛 血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，温育，以封闭 非特异性位点，然后用含有放射性标记或酶 标记的特定抗体杂交，抗原-抗体结合，再通 过放射性自显影或显色观察。w ELISA与经典的同位素标记为基础的液 液抗原抗体反应体系不同之处在于 建立了固液抗原抗体反应体系，并采 用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反 应来检测。 w 由于酶的放大作用，使测定的灵敏度极 高，可检测出1pg的目的物，同时酶反 应还具有很强的特异性。
