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1、枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 B.SUBT12B.SUBT12 酶学性质浅析酶学性质浅析摘 要：考察了分离得到的一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌B.SUBT12 最适作用温度、pH 值以及温度、pH 值、金属离子和表面活性剂对酶稳定性的影响。试验研究表明：该酶最适作用温度为 55，最适作用 pH 为 7.5，酶在 55反应45min 仍有 50%的酶活力，热稳定性较好。金属 Ca2+和表面活性剂 Tween-80 对酶有一定的激活作用，但激活作用不太明显。关键词:枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶；酶学性质；中国分类号: Q925.2 文献标码: A中性蛋白酶是一类适合于在中性条件下水解蛋白质肽键的酶类,最早被
2、发现并广泛应用于工业化生产,可用于皮革脱毛、动物血液蛋白酶水解制备复合氨基酸营养液1、大豆蛋白水解2以及医学治疗3等应用领域中。目前国内外有关中性蛋白酶的研究相当的多1-7。酶作用条件不是酶的特征性参数,因环境的改变而改变,酶活力不仅受温度、pH 的影响,而且还易受到金属离子、表面活性剂等环境因素的影响。因此,本试验着重考察了酶反应体系温度、pH值、金属离子以及表面活性剂对酶作用条件及稳定性的影响,希望通过此研究得到 B.SUBT12 的最佳反应条件和酶的稳定性,为其应用奠定良好的理论基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试菌种 由课题组分离得到，经初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacill
3、us subtilis )。1.1.2 培养基1.1.2.1 牛肉膏蛋白胨培养基8 培养基配方略。1.1.2.2 发酵培养基9 培养基配方略。1.2 方法1.2.1 菌种鉴定 通过观察菌落形态、培养特性及生理生化特性等对 B.SUBT12 进行鉴定。1.2.2 酶活力测定 按 Folin-酚法101.2.4 酶最适作用温度 将稀释粗酶液分别于 40、45、50、55、60、65、70不同温度下反应,测定其蛋白酶活力。以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。1.2.5 酶最适 pH 值的研究 分别配制 pH(3.010.5)不同的 1%的干酪素溶液,按 Folin-酚法10进行蛋白酶活力测定。以
4、 pH 为横坐标,以相对酶活力为纵坐标作图。其中pH3.0-5.0 由 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制,pH6.0-8.0 由磷酸缓冲液配制,pH9.0 由硼酸缓冲液配制,pH10.0 由硼砂-NaOH 缓冲液配制。1.2.6 温度对酶稳定性的影响 取 20ml 稀释粗酶液于55恒温水浴10min、20min、30min、40min、50min、60min,然后测定其残存酶活力,以时间为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。1.2.7 pH 对酶热稳定性影响 用 pH7.5 的缓冲液定容1ml 粗酶液至 100ml,分别取 20ml 稀释酶液于 40、50、60、70保温 30min,测残余酶活。
5、以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。1.2.8 金属离子对酶稳定性的影响 在稀释酶液中加入0.1mol/L 的不同金属离子,保温 30min,测定蛋白酶活力,以金属离子作横坐标,蛋白酶活力作纵坐标作图。1.2.9 表面活性剂对酶稳定性的影响 在稀释粗酶液中加入不同体积的表面活性剂 Tween80 (1-5ml),于 40保温30min,然后测定其蛋白酶活力。以 Tween-80 添加量作横坐标,酶活力为纵坐标作图。2 结果与分析2.1 菌种鉴定细胞杆状,成链状排列,端口成圆形,芽孢椭圆或圆形,单芽孢,兼性好氧,能利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖产酸。葡萄糖产气,最适生长温度
6、35-37, 5和 50以上无法生长,菌落成乳白色,边缘整齐,表面有皱褶、隆起,菌落表面干燥,G+,菌落不透明,M.R 试验、V.P 试验、过氧化氢酶试验均为阳性,可利用丙二酸盐。初步鉴定为枯草芽孢杆菌.2.2 酶最适作用温度将粗酶液分别于不同温度下反应,测定其蛋白酶活力。结果如图 1。从图 1 可以看出，酶在 55酶活性最高，在45-60有较好的稳定性，酶最适作用温度为 55。2.3 酶最适作用 pH 值将稀释粗酶液于不同 pH 值的缓冲液体系中反应,然后测定其蛋白酶活力,结果如图 2。从图 2 可以看出,酶在 pH7.5缓冲液体系中酶活力最高。因此酶最适 pH 为 7.5。图 1 酶最适作
7、用温度 图 2 酶最适作用 pH 值2.4 温度对酶稳定性的影响将酶液于 55保温10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min 后,按 Folin-酚9法测定蛋白酶活力,结果如图 3。从图 3 可以看出,酶的热稳定性较好。在 55保温 45min 仍保持有近50%活力,当保温时间延长至 60min 或更长时,酶因热变性活力急剧下降甚至没有了活力。2.5 pH 对酶热稳定性的影响将 1ml 酶液用 pH7.5 缓冲液稀释到 100ml 并于 55分别保温 40min、50min、60min、70min,然后测定其蛋白酶活力,结果如图 4。从图 4 可以看出,
8、pH 对酶有一定的保护作用。在此体系中反应,酶保温 60min 仍有近 50%的活力,保温时间继续延长到 70min 时,酶因热变性酶活急剧降低。如果继续加长酶液的保温时间,酶会因为热变性完全失活。2.6 金属离子对酶稳定性的影响在稀释粗酶液中加入 0.1mol/L 不同的金属离子 40保温 30min,然后按 Folin-酚法测定蛋白酶活力,结果如图 5。从图 5 可以看出,Ca2+对酶有一定的激活作用和稳定作用,但激活作用不明显,这与许多相关报道相同11-13。Fe3+ 对酶有强烈的抑制作用,作用机理有待于更一步深究。2.7 表面活性剂对酶稳定性的影响向稀释粗酶液中加入不同体积的 Twee
9、n-80,40保温30min,测定其蛋白酶活力。试验结果表明,表面活性剂对酶有不同程度的激活作用(图略)。当添加量为 5ml 时,酶活达1286.36U/ml,比空白提高了近 12.09%。可能作用机理为：表面活性剂亲水亲油基团有利于增强细胞膜的通透性,微生物蛋白水解酶均为胞外酶,膜通透性的增强有利于酶从膜内往外运输,也有可能是由于细胞膜通透性的改变打破细胞内酶合成的平衡机制,因此提高了发酵液中蛋白酶的产量。3 结论与讨论B.SUBT12 经初步鉴定为枯草芽孢杆菌，酶学性质研究表明最适作用温度为 55，最适作用 pH 值为 7.5，酶的热稳定性较好，pH 对酶有一定的保护作用，在 pH7.5
10、的反应体系中，酶在 55保温 60min 时，酶有 50%的活力，时间延长至 70min 时，酶仍有 30%的活力，缓冲液对酶的“保护”作用可能是由于缓冲液有利于酶三级结构的稳定，因此，温度对其作用效力得到缓和。金属离子对酶有一定的激活作用，但激活作用不太明显，可能是由于“金属桥”的形成有利于酶与底物的结合。表面活性剂对产酶也有激活作用，添加 5ml Tween80 到反应体系中,酶活提高了 12.09%。参考文献1 卢寅泉,刘昭明 酶技术开发动物血制取复合氨基酸营养液的研究J 食品科学.1995, 16(7).-13-182 郑玉锖,李 珑 大豆分离蛋白酶解过程的研究与产物分析J 福州大学学
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